纤溶酶原激活剂抑制物―1基因启动子区4G/5G、―844G/A单核甘酸多态性及其单倍型与缺血性脑卒中的关联分析

【摘要】 目的 研究广东粤西地区汉族人PAI-1基因启动子区4G/5G、-844G/A单核甘酸多态性及其单倍型与缺血性脑卒中的关系。方法 用ELASA方法测定130例广东粤西地籍缺血性脑卒中患者和130名广东粤西地区籍正常对照个体的血浆PAI-1水平， 用等位基因特异性PCR或PCR-限制性片段长度多态法测定基因型， 用EH+程序分析单核甘酸多态性的单倍型， 用卡方检验分析病例组和对照组的基因型、等位基因频率及单倍型频率的差异。结果 4G/5G、-844G/A的基因型、等位基因频率在病例组和对照组之间的差异有统计学意义（P

【关键词】 纤溶酶原激活剂抑制物-1； 单核甘酸多态性； 缺血性脑卒中； 连锁不平衡分析；单倍型

纤溶功能下降是多种血栓性疾病的重要发病机制之一， 纤溶酶原激活剂抑制物-1主要生理功能为抑制组织型纤溶酶激活物和尿激酶型纤溶酶激活物的活性， 是参与调节纤溶系统活性的平衡的重要组成部分， 而纤溶活性的平衡是防止血栓形成的重要保护机制。目前研究发现， 血浆PAI-1水平受多种环境因素及遗传因素影响， 其中PAI-1基因启动子区的某些功能性单核苷酸多态性如4G/5G、-844G/A与血浆PAI-1水平的增高有关。但PAI-1基因单核甘酸多态性与缺血性心脑血管疾病在不同地区， 人群及种族的研究结果不一致， 一直存在争议。本研究初步探讨了位于PAI-1基因启动子区域的4G/5G、-844G/A单核苷酸多态性与缺血性脑卒中（IS）发病的关系， 现报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 所有对象来自广东粤西地区汉族人。其中病例组系2002年8月～2003年8月本院神经内科住院的72 h发病的初治缺血性脑卒中患者共130例， 为病例组， 男78例， 女52例， 平均年龄（64.81±8.87）岁。所有病例均符合WHO诊断标准。正常对照组：随机选择同期健康体检者， 均排除心、脑血管疾病， 无高血压、糖尿病、高血脂及遗传疾病史， 共112例， 对照组男67例， 女45例， 平均年龄（63.05±7.06）岁。

1. 2 方法 缺血性脑卒中患者（发病后， 治疗前）及正常对照组个体于清晨空腹、卧位采集肘静脉血5 ml， 以3.8%枸橼酸钠1：9抗凝， 室温下离心分离血浆置于- 80℃保存， 酶联免疫吸附剂测定法（ELISA）检测血浆PAI-1水平。

1. 3 采用盐抽提法[1]， 稍作改良以从白细胞中抽提基因组DNA。

1. 4 PCR扩增 参照文献[2]设计引物序列， 序列及酶解片段见表1 （引物由上海工生物工程技术服务有限公司合成）。扩增体系如下：总反应体积25 μl， 含待测基因组DNA 0.2 μg， dNTP 0.2 mmol/L， MgCl2 1.5～2.5 mmol/L， 10×buffer 2.5 μl， Taq酶0.75 U， 上下游引物各42 μmol/L， 扩增条件为：95℃预变性7 min， 94℃变性55 s， 退火条件见表1， 72℃50 s， 循环32次。

1. 5 酶切PCR产物及电泳分析 取-844G/A位点的PCR产物15 μl， 加入限制内切酶Xho I 5 U及相应酶切缓冲液37℃水浴过夜。将4G/5G位点 PCR扩增产物及-844G/A位点酶切产物在3%琼脂糖凝胶上电泳， 用溴化乙锭染色， 紫外线灯照射下观察并照相。根据电泳图谱确定基因型。

1. 6 统计学方法 所有资料输入Microsoft Excel 97中建立数据库， 并运用SPSS17.0统计软件对所有数据进行分析处理。应用基因记数方法计算出相对等位基因频率。计量资料用均数±标准差（ x-±s）表示， 用t检验， 基因型Hardy-Weinberg平衡吻合度采用χ2检验。采用EH+软件进行连锁不平衡分析及单倍型分析。多态性位点与缺血性脑卒中患病风险之间的相关性用比值比（odds ratios， OR）及其95%可信区间（confidence intervals， CI）表示。P

2 结果

2. 1 病例组及对照组临床资料比较 见表2。两组样本中的性别比例、年龄、总胆固醇、甘油三脂、血糖水平等均无统计学意义， 而血压（收缩压和舒张压）和血浆PAI-1水平的差异有统计学意义（P

2. 2 PAI-1基因4G/5G、-844G/A单核甘酸多态性基因型和等位基因频率分布 病例组及对照组中4G/5G、-844G/A多态性位点基因型分布均符合Hard-Weinberg平衡， 均具有群体代表性。病例组和对照组之间两个位点的基因型频率和等位基因频率的差异有统计学意义（P

2. 3 单倍型分析 PAI-1基因4G/5G、-844G/A单核甘酸多态性所构建的单倍型有4种， 见表4。单倍型分析结果显示4G-A-844在病例组的频率较高， 与对照组的差异有统计学意义， 而5G-G-844在对照组的分布频率高于病例组（P

3 讨论

体外实验发现， PAI- 1基因4G/5G多态性位点的5G等位基因与 4G等位基因相比， 在 PAI- 1启动子区插入了 1 个碱基而创造了一个白（因子B）的结合位点， 此蛋白可行使转录抑制作用。而4G位点只结合转录因子， 具有较高的PAI-1基因转录速率， 且4G/4G纯合子型者的细胞有较高的 PAI- 1 分泌功能和血浆较高 PAI- 1水平。PAI-1基因启动子区的另一个单核甘酸多态性位点-844G/A位于潜在的Ets蛋白DNA的限制序列， 能影响PAI-1基因的转录[3]。提示血浆 PAI-1 水平和 PAI-1 基因启动子区4G/ 5G、-844G/A等功能性位点之间有直接关系。高水平的PAI-1可以抑制 t-PA ， 导致纤溶活性降低， 参与血栓的形成； 同时促进动脉粥样硬化及动脉壁增厚， 故易于导致缺血性脑卒中等心脑血管疾病的发生。近年来的病例对照研究结果表明PAI-1基因4G/5G、-844G/A单核甘酸多态性位点与IS的发病密切相关， 是IS的重要危险因子之一， 可增加IS的发病风险[4， 5]。然而， 亦有部分研究结果未发现PAI-1基因多态性与IS关联。

本文研究结果显示， 在IS组中， 以4G/5G位点的4G4G基因型个体为多， 其分布频率最高（0.469）， 4G等位基因的频率为0.6577。而正常对照组4G/5G位点4G4G基因型相对较低（0.232）， 4G、5G等位基因的频率分别为0.5117、0.4883， 与病例组比较差异有统计学意义（P

4G/5G和-844G/A单核甘酸多态性毗邻， 均位于PAI-I基因启动子区域。通常认为相距较近的位点连锁不平衡程度较紧密。Kathiresan等的研究认为由于4G/5G和-844G/A单核甘酸多态性之间存在紧密连锁不平衡关系， 故不易判断哪个位点通过影响血浆PAI-1水平而导致缺血性心脑血管疾病的发生。因此， 为了进一步了解两个位点与IS 的关系， 作者构建了两个位点的单倍型， 发现病例组和对照组之间4G-A-844和5G-G-844单倍型分布差异具有统计学意义（P

总之， 本研究中分析了广东粤西地区PAI-1基因启动子区4G/5G、-844G/A单核甘酸多态性在IS患者中的分布频率差异， 并研究与疾病发生危险的相关性。结果表明4G/5G、-844G/A单核甘酸多态性与IS 密切关联， 4G/5G 的4G、A-844等位基因可以增加患IS 的危险性， 单倍型4G-A-844可能为IS的遗传易感因素。上述研究结果将为缺血性脑卒中的一、二级预防提供一定的线索及理论依据。

参考文献

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[5] Sarra Saidi， Lamia B， Slamia， et al.Association of PAI-1 4G/5G and -844G/A Gene Polymorphism and Changes in PAI-1/tPA Levels in Stroke. A Case-Control Study， 2007， 16（4） ： 153-159.

[收稿日期：2014-04-28]