人胚胎成纤维细胞作为组织工程皮肤种子细胞的可行性研究

[摘要]目的：评估人胚胎成纤维细胞（human embryonic fibroblasts，HEF）作为组织工程皮肤种子细胞的可行性和优越性。方法：取人流产胚胎皮肤、正常儿童皮肤，相同条件下分离培养成纤维细胞，比较两组细胞镜下、超微结构以及增殖特性，异体淋巴细胞混合实验对比其抗原性。以第三代细胞复合鼠尾胶原构建三维培养，ELASA法分别测定两组三维构建培养液中IL-6，TGF-β1含量。结果：与普通成纤维细胞相比，胚胎成纤维细胞扩增后具有更好的细胞形态和功能，生长速度快，分裂指数高，几乎不刺激异体淋巴细胞增殖。在鼠尾胶原支架中成纤维细胞生长状态良好，并且具有一定的组织强度。胎儿成纤维细胞组培养液中的TGF-β1和IL-6在各个时相上分别显著低于和高于普通成纤维细胞组。结论：胚胎成纤维细胞是组织工程皮肤较理想的种子细胞。

[关键词]】组织工程；皮肤；无斑痕愈合；胚胎；成纤维细胞

[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）04-0605-04

Investigation on feasibility of constructing engineered skin substitutes with human embryonic fibroblasts

LIU Liu1,LI Wu-de1,CAI Guo-bin2

（1.Cleft lip and Palate Treatment Center,China Meitan General Hospital,Beijing 100028,China;2.Scar Integrated Treatment Centre,Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College,Beijing 100041,China）

Abstract:ObjectiveTo assess the biological and functional properties oftissue-engineered three-dimensional (3D) composites seeded with human embryonic fibroblasts （HEF）.MethodsFibroblast cultures were developed from biopsies of human fetus and children. To determine the differences between fetal andfibroblasts, the cell shape, ultrastructure, growth cycle were observed. In addition, mixed lymphocyte culture was examined to evaluate the antigenicity. Three-dimensional skin constructs were obtained by seeding cultured cells in rat tail collagen scaffold. The content of IL-6 and TGF-β1 in the dermis culturing supernatant was measured by ELISA method.ResultsIn monolayer culture, HEF displayed more typical pattern and faster growing rate. HEF was poor stimulators of lymphocyte proliferation. In 3D culture, fetal constructs appeared more developed based on gross examination with significantly higher level secretion of IL-6 and lower of TGF-β than adults'(P

Key words: tissue engineering; skin; scarless wound healing; fetal fibroblast

寻找理想的种子细胞一直是组织工程皮肤领域的热点和难点，由于种子细胞增殖能力有限、抗原性、与基质相容性差等问题，存在着皮肤产量低，移植后排斥反应等缺陷。前2/3妊娠期的胚胎在受到创伤后具有无瘢痕愈合的能力，而这种愈合能力完全是由胎儿自身组织细胞的内在特性决定的[1]。我们取材于人胎儿皮肤、儿童正常皮肤进行成纤维细胞培养，比较其生长特性、形态学、生长动力学以及免疫原性差异，并复合鼠尾胶原构建人工真皮，观察种子细胞在三维构建中的增殖和功能,以探讨人胚胎成纤维细胞（human embryonic fibroblasts，HEF）作为组织工程皮肤种子细胞的可行性和优越性,为组织工程种子细胞的选择及将细胞移植用于临床提供实验依据。

1材料和方法

1.1主要仪器和试剂：MCO-15A型C02培养箱，倒置生物显微镜，超净工作台，台式高速离心机，恒温水浴箱，常规医用手术器械，日本H-600透射电镜；全自动蒸汽消毒器，针式滤器；培养基（DMEM:F12为1:1，含10%胎牛血清），中性蛋白酶。

1.2 二维培养以及相关实验

1.2.1 成纤维细胞取材：①实验组：5例，取人孕中期（20～28周）引产胎儿，性别不限；②对照组：12例，取自12岁以下瘢痕患者手术改形时修剪下的正常皮肤。

1.2.2 成纤维细胞的培养和传代：采用组织块法培养：将标本消毒后无菌条件下取中厚皮，切成1～1.5mm3的小块，将组织块贴到培养瓶内，加入培养基孵育，待成纤维细胞达60%～70%左右，传代培养。取两组第三代细胞进行光镜、透射电镜观察，绘制细胞生长曲线。

1.2.3 淋巴细胞体外增殖实验，参考文献[2]中毕建军等的方法，计量数据用均数士标准差(x±s)表示。P

1.3 三维培养以及相关实验

1.3.1 制作三维构建：取第三代HEFs和普通FBs，制成1×106个/cm3细胞悬液。迅速与鼠尾胶原液、重组缓冲液（2.756g碳酸钠、4.766gHEPES、0.35gNaOH溶于100ml蒸馏水中）以1200:4200:300的比例加入6孔培养板中，在孵箱内孵育30min后即形成胶原凝胶。加入DMEM:F12为1:1的含10%胎牛血清的培养基在孵箱内继续培养。

1.3.2 测定构建培养液中TGF-β1和IL-6含量：分别在1天、3天、5天、7天、9天、11天、14天每天收集两组各6个孔培养液，每次换液两组加液量均为5ml，用人IL-6、TGF-β1 ELISA试剂盒检测细胞因子含量。

2结果

2.1 二维培养阶段

2.1.1光镜下观察：同等培养条件和时间，HEF贴壁覆盖面积大于普通FB，HEF呈梭形、多边形或不规则形，边缘不整齐，极性排列不规则。细胞折光性强。普通细胞更容易呈束状排列（图1.1,图1.2）。

2.1.2 透射电镜下观察：HEF（第三代）功能活跃，表现为细胞体积大，胞浆丰富，胞核及核仁增大，胞膜与核膜折皱加深，胞浆内微丝粗大，沿细胞长轴平行排列，未见细胞连接（图2.1，图2.2）。细胞质内含有丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体。

2.1.3 同代(P3)HEF和普通FB细胞生长曲线：在细胞生长前3天，两组细胞增殖速度相似，其后均进入对数生长期，HEF增殖速度超过普通FB，更早进入平台期，而后HEF仍保持着较高的生长密度（图3）。

2.1.4 淋巴细胞增殖实验：普通FB：与对照组相比原代～V代均有明显差异。组间比较：P0、P1与其它各代差异明显(P0.05)，P2与P4,P5仍有明显差异(P0.05)。

HEF：与对照组相比原代有明显差异（P

2.2 三维培养阶段：两组培养液中TGF-β1和IL-6含量的比较：各组成纤维细胞培养后的第一天，即可检测到一定水平的TGF-β1和IL-6。两组细胞IL-6随着培养时间的延长分泌量增多，到第9天到达稳定高值水平，至第11天于第7天含量比较无统计学意义（P>0.05）；胎儿组IL-6含量在各时间点都高于成人组（P

3讨论

3.1 HEF是构建组织工程皮肤的理想种子细胞，长期以来动物来源的胚胎成纤维细胞被广泛深入研究，发现其在胶原沉积、细胞分泌，细胞信号传导等方面存在一定的自主性[3]，在分子水平，胚胎皮肤创伤后其WNT信号通路途径，细胞对WNT3a基因调控的应答都与普通FBs有本质区别[4]。2005年，Hohlfeld[5]等利用HEF与马胶原覆盖深度烧伤，发现烧伤创面愈合速度与质量都有明显改善,大大推进了HEF组织工程皮肤的发展。但针对扩增后HEF的基础实验研究并不多见，本研究为填补这一薄弱环节，对HEF的二维、三维培养进行较全面观察，再次验证了胎儿无瘢痕愈合与细胞本身特性密切相关，也为组织工程皮肤种子细胞选择和皮肤构建方法奠定了基础。

3.2 二维培养中，与普通成体FB相比，HEF呈现出更加良好的细胞状态，呈典型的纺锤状，贴壁面积更大，生长更旺盛,细胞寿命更长。透射电镜下HEF胞膜与核膜折皱加深，胞浆内微丝粗大，细胞质内含有丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体，说明细胞的功能活跃。HEF约3天传代一次，可传25代而保持细胞基本形态。HEF细胞生长曲线近似“S”形，具有生长速度快，分裂指数高，代谢迅速和分泌功能旺盛的特点。以相同的初始接种密度培养，两组细胞均具有密度依赖性抑制，但HEF比后者具有更大的最大生长密度，这可能是由于胎儿细胞体积小，容积相同时，数量较多，也可能是由于单位细胞消耗营养物质较少所致。

3.3 HEF与淋巴细胞混合培养几乎可以不刺激其增殖，说明其低抗原性。HEF原代培养与对照组和其他代间均存在着显著差异（P

3.4 以往对种子细胞的研究很多是由二维培养结果对三维构建特性进行推断，这并不科学，因为细胞贴附的化学物理性质，细胞周围培养基血清含量，接种密度等条件都不同。本实验用鼠尾胶原作为支架构建三维培养，发现HEF比普通FB增殖更好，细胞功能更好，对支架的吸附性更好，体现了它良好的适应能力，验证了以往文献[6]。随着培养时间的延长，两组构建都表现出程度不同的收缩，并与细胞增殖具有时相性关系，即在细胞刚刚种植时，凝胶并未出现明显的收缩，在细胞增殖最旺盛时，凝胶收缩最剧烈。胶原的收缩是由成纤维细胞伸出突起对胶原纤维施加牵拉张力，使胶原纤维重新排列所致[7]。本实验中HEF增殖快，分泌旺盛，其三维构建表现出了更强的机械力学特性，收缩更加剧烈。

3.5 对三维构建培养液中细胞因子动态观察，其目的在于观察细胞的分泌特性，并间接了解种子细胞在鼠尾胶原中的存活和功能。IL-6是表皮细胞的一种丝裂原，可加速创面表皮化[8]。本实验发现与普通FBs相比，HEF的IL-6分泌更加旺盛，两组三维培养的IL-6含量上升趋势与各组FBs数量增殖趋势基本平行。TGF－β1参与创面愈合的全过程[9]，对细胞分化、免疫功能、细胞增殖、炎症过程具有双相调节作用，可促进胶原合成与成熟[10-11]，能够刺激血管生成和上皮化，刺激FBs的增殖、分化，促进肉芽组织形成，导致瘢痕的产生[12]。本实验发现HEFs的TGF-β1分泌量在各时相均少于普通成纤维细胞，且随时间增加的幅度并不大，说明HEFs的TGF-β1一直处于低分泌水平，并不随细胞数增加呈几何倍数增长。

我们的研究表明HEF具有旺盛的繁殖能力和低免疫原性，在鼠尾胶原凝胶中保持着活跃的生物学特性，是理想的组织工程种子细胞。但创面愈合是一个复杂的过程，涉及到各种细胞间的相互作用、细胞与基质间的作用以及多种炎症因子和细胞因子的作用，如何利用动物实验进一步探索HEF组织工程皮肤的有效性和安全性以及其治疗流程和机制，并建立HEF细胞库，将其广泛应用于临床，是一个有深远意义的研究课题。

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[收稿日期]2010-12-26[修回日期]2011-03-12