铁皮石斛茎段组织培养技术研究

2019-07-14 版权声明 举报文章

摘 要:以铁皮石斛丛生芽作为外植体,通过研究影响铁皮石斛生长的主要因素,筛选铁皮石斛茎段组培快繁的适宜培养基,总结实用的快繁方法。结果表明,以MS培养基+6-BA 0.5mg/L+ NAA 0.2mg/L+30g/L糖+6.5g/L琼脂+0.5g/L活性炭,添加10%的香蕉泥作为天然附加物,pH值5.8,是铁皮石斛丛生芽增殖的最佳培养基;以MS+IBA 1.5mg/L+NAA 1.5mg/L为铁皮石斛生根诱导的最佳培养基。通过实验总结出铁皮石斛茎段组培快繁技术,为铁皮石斛的资源保护和应用推广提供重要的科学依据。

关键词:铁皮石斛;组织繁殖;增殖分化;壮苗生根

中图分类号 S567.239 文献标识码 A 文章编号 1007-7731(2013)13-32-03

Study on Tissue Culture Techniques for Stem Segment of Dendrobium officinale

Qi Huasha et al.

(Garden Flower Research Institute of Hainan Academy of Agricultural Sciences,Haikou 571100,China)

Abstract:The regeneration methods of bud clumps was adopted to establish a rapid technique system of propagation in Dendrobium officinale in this experiment. The result showed that the best multiplication medium is MS+ 6-BA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+30g/L sugar+6.5g/L agar+0.5g/L activated carbon,add 10% banana mud,pH5.8.And MS+IBA 1.5mg/L+NAA 1.5mg/L for the best rooting medium of Dendrobium candidum. This techniques of tissue culture for Dendrobium officinale provided an important scientific basis for resource protection and application.

Key words:Dendrobium officinale;Tissue culture;Proliferation;Rooting

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)为兰科多年生附生草本植物,长于海拔达1 600m的山地半阴湿的岩石上,并常与苔藓植物伴生,喜温暖湿润气候和半阴半阳的环境,一般在-5℃以下的低温停止生长[1-2]。铁皮石斛具有极高的药用价值和经济价值,其新鲜茎或干燥茎均可入药,是我国最常用传统药材与中成药的原料药。其味甘淡,性微寒,用于治疗阴伤津亏,口干烦渴,食少干呕,病后虚弱,目暗不明等症,为中国十大仙草之一。现代药理研究表明,铁皮石斛具有降血糖、增强抵抗力的功效[3]。由于生长条件特殊和分布局限,以及长期采挖,铁皮石斛的自然资源濒临枯竭,供应紧缺,目前铁皮石斛已被列为国家重点保护药用植物、中国珍稀濒危二级保护植物和世界二类保护植物[4]。铁皮石斛自然繁殖率很低,采用传统的分株繁殖法,繁殖速度比较慢,且植株生长不一致,抗病虫害能力差[5],利用组培快繁技术繁殖试管苗,不仅是解决铁皮石斛野生资源紧缺的有效方法,也对该物种的种质资源保护起到积极的作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料 本实验用的铁皮石斛采自于海南省五指山市五指山山上,采回后栽种在海南省农业科学院兰圃实验园用于实验。

1.2 方法

1.2.1 灭菌及接种方法 选择生长旺盛、无病害的铁皮石斛健康植株,用刀片切取长为3~5cm的顶芽,剥去节上叶片,放置于洗洁精溶液中摇荡2min,再用自来水冲洗;沥干水后,在超净工作台上,先用75%的乙醇浸泡15s,无菌水冲洗3次,再用0.1%升汞浸泡14min,用无菌水冲洗5次。每次取一块茎段,切除两边顶端,将茎段放置诱导培养基上,诱导分化产生丛生芽,取丛生芽做以下实验。

1.2.2 培养条件 本实验的各个培养阶段中,培养物均置于培养光照强度为1 500~2 000lx日光灯照明条件下,培养温度为25℃,每天光照10~12h[6]。

1.2.3 培养基配制方法 本实验中所采用的各种培养基均按照植物培养的常规方法配制和灭菌。

1.3 试验设计

1.3.1 不同浓度的6-BA+NAA0.2mg/L对铁皮石斛丛生芽增殖的影响 本试验在MS基本培养基中分别添加6-BA0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/L和NAA0.2mg/L,选取长势一致的丛生芽接入上述7种培养基,每个处理20袋,每袋8株,即每个处理160株,50d统计增殖系数,观察生长状况。

1.3.2 天然附加物对铁皮石斛丛生芽增殖的影响 在MS基本培养基中分别加入椰子水、香蕉泥、马铃薯泥(香蕉泥用新鲜果实打浆而成,马铃薯泥用新鲜块茎去皮打浆而成)各10%,切取丛生芽接种到继代培养基上进行继代培养,每个处理20袋,每袋8株,即每个处理160株,50d统计增殖系数,观察生长状况。

1.3.3 不同浓度的活性炭对铁皮石斛丛生芽的增殖影响 本实验在MS+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L+10%香蕉泥的基本培养基中分别添加0.3g/L、0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L的活性炭,选取长势一致的丛生芽接入上述5种培养基及对照组,每个处理20袋,每袋8株,即每个处理160株,50d统计增殖系数,观察生长状况。

1.3.4 不同生长素对铁皮石斛生根诱导的影响 以植株高达2~3cm的无根袋苗转接到生根培养基上作为生根培养,培养条件同上。选择不同配比浓度的两种生长素作为铁皮石斛生根培养影响的研究,筛选出适宜铁皮石斛生根壮苗的培养基。根据分化增殖培养基对铁皮石斛的影响,设置以下10种配比浓度诱导生根(见表4)。将丛生苗切成无根单株转接到生根培养基上,每个处理40袋,每袋8株,即每个处理320株,培养50d统计生根生长状况。

2.1 不同浓度6-BA+NAA0.2mg/L对铁皮石斛丛生芽增殖的影响 不同浓度的6-BA+NAA0.2mg/L对铁皮石斛丛生芽的影响不尽相同,中小苗接入培养基中培养15d后均开始长出新芽,25d后芽增长明显,培养50d的生长情况见表1。其中以0.5mg/L的增殖效果最好,增殖系数达4.72倍,生长状况为长势好,植株健壮,种苗多,高达3.2cm;浓度0.5~3.0mg/L的范围内,随着6-BA浓度的增加,丛生芽增殖系数逐渐的减少,增殖系数维持在一个较高的水平上波动(波动范围在1.70~4.72倍)。可见,高质量浓度的6-BA对铁皮石斛丛生芽增殖有一定的抑制作用,因此比较合适铁皮石斛丛生芽增殖培养基为:MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L。

表1 不同浓度的6-BA+NAA0.2mg/L对铁皮石斛

丛生芽增殖的影响

[6-BA的浓度(mg/L)\&起始芽

数(株)\&增殖后芽数(株)\&增殖系数(倍)\&生长状况\&0.1\&160\&568\&3.55\&长势好,植株健壮,苗多,种苗高达3.2cm\&0.5\&160\&755\&4.72\&长势好,植株健壮,苗多,种苗高达3.5cm\&1.0\&160\&526\&3.29\&长势好,植株健壮,种苗高达2.9cm\&1.5\&160\&496\&3.10\&长势一般,种苗高达2.5cm\&2.0\&160\&345\&2.16\&长势一般,种苗高达2.2cm\&2.5\&160\&302\&1.89\&长势弱,种苗高为0.5~1.5cm\&3.0\&160\&272\&1.70\&长势弱,芽细\&]

2.2 天然附加物对铁皮石斛丛生芽增殖的影响 培养基:MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L加入3种10%天然附加物对铁皮石斛丛生芽的增殖系数有明显的影响(见表2),其中椰子水对铁皮石斛丛生芽的增殖促进作用最大,增殖倍数达到4.82倍,其次是香蕉泥,增殖系数达到4.74倍,第三为马铃薯泥,增殖系数达到3.92倍。添加3种天然附加物相对于ck表现为粗壮,叶色浓绿,生长整齐,并且增殖系数较高,所以3种有机附加物对铁皮石斛丛生芽的分化有促进作用。而ck和马铃薯泥在培养后期均会出现黄化现象,需要及时转瓶,因此,在生产铁皮石斛种苗时以香蕉及椰子水作为添加物为宜。

表2 不同天然附加物对铁皮石斛丛生芽增殖的影响

[天然附加

物种类\&起始芽数

(株)\&增殖后芽数

(株)\&增殖系数

(倍)\&生长状况\&ck\&160\&323\&2.02\&芽苗细弱,轻微的玻璃化\&椰子水\&160\&771\&4.82\&芽苗正常,且整齐健壮,绿色\&马铃薯泥\&160\&627\&3.92\&芽苗正常,绿色\&香蕉泥\&160\&758\&4.74\&芽苗健壮,深绿色\&]

2.3 不同浓度活性炭对铁皮石斛丛生芽的增殖影响 培养基:MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+10%香蕉泥,加入不同浓度的活性炭对铁皮石斛丛生芽增殖系数的影响见表3,其中0.5g/L的活性炭对铁皮石斛丛生芽的增殖促进作用最大,增殖系数达到4.83倍,其次是1.0g/L的活性炭,增殖系数达到4.81倍,在不加活性炭的培养基中丛生芽的增殖系数最低,为3.90倍,而且芽苗长势差,苗不整齐,部分还出现叶片枯黄现象,而在添加不同浓度活性炭的所有培养基中,丛生芽分化多,叶绿,增殖系数均高于不加活性炭的处理。结果表明,1.0g/L及0.5g/L的活性炭浓度,丛生芽增殖系比较高;浓度0.5~2.0g/L的范围内,随着活性炭浓度的增加,丛生芽增殖系数依次减少,但活性炭浓度的影响维持在一个较小的水平上波动(波动范围在4.83~4.75倍),差别不是很明显。因此,铁皮石斛丛生芽的继代增殖培养以选择低浓度的活性炭为宜,即0.5g/L。

表3 不同浓度活性炭对铁皮石斛丛生芽的增殖影响

[活性炭浓度

(g/L)\&起始芽数

(株)\&增殖后芽数

(株)\&增殖系数

(倍)\&生长状况\&0\&160\& 624\&3.90\&长势差,苗不整齐,

部分叶枯黄\&0.3\&160\&768\&4.80\&芽苗正常,绿色\&0.5\&160\&772\&4.83\&芽苗正常,绿色\&1.0\&160\&769\&4.81\&芽苗正常,绿色\&1.5\&160\&761\&4.76\&芽苗正常,绿色\&2.0\&160\&760\&4.75\&芽苗正常,绿色\&]

2.4 不同浓度的两种生长素对铁皮石斛根系发育的影响 试验不同浓度的IBA和NAA两种生长素对铁皮石斛生根壮苗的影响,二者分别设定了不同的浓度交叉处理(见表4)。不同生长素对铁皮石斛生根发育有明显的影响,其中以IBA1.5mg/L+NAA1.5mg/L处理的效果最明显,其平均根数达4.5条/株,平均每株的根长为2.65cm,而且根系粗壮,较发达;IBA0.1mg/L+NAA2.0mg/L处理的效果次之,平均根数达4.2条/株,平均每株的根长为2.45cm,根粗长,苗壮;添加2种生长素对铁皮石斛的生根都有促进作用,不加生长素表现为苗弱,根细,根短,根数少;各浓度处理组平均根数、根长、株高的影响效果均呈抛物线分布。上述数据表明,能使无菌苗生根效果好的培养基配方为IBA1.5mg/L+NAA1.5mg/L及IBA0.1mg/L+NAA2.0mg/L,生长的根粗细均匀,根多,平均根数为4.2~4.5根/株,根长2.45~3.65cm,株高3.8cm以上,苗壮,有利于炼苗移栽。

表4 不同浓度的两种生长素对铁皮石斛生根诱导的影响

[IBA的浓度

(mg/L)\&NAA的浓度

(mg/L)\&平均根数

(条/株)\&平均根长

(cm)\&株高

(cm)\&生长状况\&0\&0\&1.92\&1.08\&2.34\&苗弱,根细,根短\&0.1\&0.1\&2.66\&1.21\&3.03\&根少,且短\&0.5\&0.5\&3.12\&1.42\&3.59\&根少,略长些\&1.0\&1.0\&3.20\&2.02\&3.78\&粗细正常\&1.5\&1.5\&4.50\&2.65\&3.86\&根较粗,生长较快\&2.0\&2.0\&3.62\&2.68\&3.89\&根粗长,苗壮\&0.1\&2.0\&4.20\&2.45\&3.80\&根粗长,苗壮\&0.5\&1.5\&4.01\&2.65\&3.67\&根粗长,根长\&1.0\&1.0\&3.90\&2.11\&3.00\&根粗短,根多\&1.5\&0.5\&3.11\&2.01\&2.98\&根少且短,苗小\&2.0\&0.1\&2.90\&1.98\&2.95\&根少且短,植株瘦弱\&]

3 结论与讨论

3.1 关于多个因子对铁皮石斛丛生芽增殖的影响 铁皮石斛是一种附生植物,在组织培养工作中,注意调整它的营养成分,满足其生长分化增殖,是该植物组织培养成功的关键所在。本试验通过不同浓度的6-BA+NAA0.2mg/L对铁皮石斛不定芽增殖的影响,筛选6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L培养基是适合于铁皮石斛生长分化增殖的基本培养基,它具有营养全面、激素适中、生长良好等优点。通过对3种天然附加物+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L对铁皮石斛芽增殖率有明显的影响试验表明,椰子水对铁皮石斛芽的增殖促进作用最大,增殖系数达到4.82倍,其次是香蕉泥,再次是马铃薯泥,但马铃薯易黄化,而椰子水相较于其它的天然附加物成本高,所以香蕉泥对铁皮石斛丛生芽增殖比较合适工厂化,可以作为今后商业化开发的重要依据。

3.2 关于调节复合生长素对铁皮石斛生根发育的影响 本试验中,采用不同生长素对铁皮石斛生根诱导的影响组合研究,弥补了以前单一生长素的一些缺陷,如:单一的NAA会使培养植物茎秆粗壮,节间短;单一的IBA会使培养植物茎秆细长,不太健康[7]。调节复合生长素比例可以收到较为理想的效果。铁皮石斛通过组织培养方法可以获得大量再生植株,从根本上解决了这一宝贵资源的挽救工作难题,在条件允许的情况下,建立保护地,采用人工栽培,可使铁皮石斛得到高效的开发利用。

3.3 展望 近年来,关于铁皮石斛组织培养与离体快繁的研究工作已取得一定的进展。建立稳定有效的组培快繁体系,不仅为铁皮石斛大规模的人工栽培提供了大量的种苗,从而满足市场对石斛药材资源的需求,还可以增加铁皮石斛的种群数量,改善其濒危现状,对铁皮石斛的种质资源保护和可持续利用提供了科学依据。但目前多数研究侧重于原球茎的诱导与增殖、丛生芽的诱导、分化与增殖以及生根培养等方面,而对再生植株人工栽培的优化研究较少,有待进一步的研究[8-9]。组培快繁技术是解决铁皮石斛野生资源紧缺和保护铁皮石斛种质资源的有效途径。如果在此基础上结合植物细胞培养技术,实现对有效药物成分的生产、分离纯化以及收集利用,无疑可以增加经济效益。

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:化学工业出版社,2005:218.

[2]《浙江植物志》编委会.浙江植物志[M].杭州:浙江科学技术出版社,1986:538.

[3]喻晓雁,陈梦媛.铁皮石斛组织培养研究进展[J].中医学报,2011(7):828-830.

[4]林江波,戴艺民,邹晖,等.铁皮石斛组培快繁技术研究进展[J].福建农业科技,2010(1):25-27.

[5]蒋林,丁平,郑迎冬,等.添加剂对铁皮石斛组织培养和快速繁殖的影响[J].中药材,2003(8):539-540.

[6]刘国民,曹孜义.实用植物组织培养技术教程[M].修订版.兰州:甘肃科学技术出版,2003:40-45.

[7]李桂锋,李进进,许继勇,等.铁皮石斛研究综述[J].中药材,2010,33(1) : 150-153.

[8]王丽萍,梁淑云,等.铁皮石斛原球茎诱导与增置研究[J].中国农学通报,2010,26(3):265

[9]蒋泽平,仲磊,李玉巧,等.IBA与IAA及CH和YE对红掌试管苗增殖和生长的调控[J].林业科技开发,2000,14(1):20-22.

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