川楝子醇提物体外肝细胞毒性研究

【摘要】目的:考察川楝子醇提物体外细胞毒性。方法:将川楝子醇提物倍比稀释后与小鼠肝细胞接触培养,通过显微镜观察其形态,采用mtt法量化细胞毒性,计算相对增殖率。结果:川楝子醇提物对肝细胞的生长抑制作用无统计学差异（p＞0.05），川楝子醇提物肝细胞毒性级别为0级。结论:川楝子醇提物无明显的肝细胞毒性。

【关键词】川楝子醇提物;细胞毒性; mtt法

川楝子(fructustoosendan) 是临床常用中药。据《中国药典》2010 年版所载为楝科植物川楝 (melia toosendansieb. et zucc.) 的干燥成熟果实，有肝小毒。本文用mtt法考察川楝子醇提物对肝细胞的毒性程度。

1 材料与方法

1.1材料与试剂。 小鼠，1640培养液，小牛血清，噻唑蓝，co2恒温培养箱，酶标仪，显微镜。

2　实验方法

2.1供试品溶液制备:用含10%血清的1640培养基将供试品稀释至所需浓度。

2.2细胞接种:用机械分离法，将小鼠肝脏剪碎，研磨，使肝细胞从肝组织上脱落,获肝细胞，制成单个细胞悬液。用含10%血清的1640培养液种植消化并稀释，将细胞密度调整为1×106个/ml，接种到96孔培养板，每孔接种200μl细胞悬液。置co2培养箱37℃培养使细胞贴壁24h。

2.3 mtt法:取8ml供试品，倍比稀释成6个不同浓度。设细胞对照组和6个不同浓度供试品组（从高到低浓度依次为ⅰ组、ⅱ组、ⅲ组、ⅳ组、ⅴ组、ⅵ组），每组8个复孔。在各孔中分别加入100μl培养液及100μl不同浓度的供试品稀释液，置co2培养箱继续培养72h。置显微镜下观察细胞形态（图1）。每孔加入mtt溶液50μl，37℃孵育4h。置显微镜下观察细胞形态（图2）。弃去孔内培养基和mtt溶液，再加入dmso 200μl，混匀10min，采用酶标仪，在492nm和630nm处分别测定吸光度a值，用各孔a492nm-对应孔a630nm，取平行4孔差值计算各组平均值。按下式计算细胞相对增殖率：

细胞相对增殖率（rgr）=a/a0×100%

式中：a为供试品组吸光度；a0为细胞对照组吸光度均值。

2.4 统计方法。

实验数据采用spss11.0统计处理，计量数据a值以（x±s）表示，采用t检验进行比较。

3 结果

3.1 细胞形态学观察。 显微镜下观察，肝细胞呈贴壁生长，细胞多呈圆形、三角形、梭形，胞浆丰富，细胞核有单或双核，呈圆形或椭圆形。在每孔加入mtt溶液37℃孵育4h后,细胞生长密集,其形态和核相均没有发生改变。结果见图1 、图2。

注：与细胞对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001

4结论

川楝子乙醇提取物无肝细胞毒性。

5讨论

细胞活性和增殖状况的测定是评价药物毒性过程不可或缺的步骤。mtt法是最为简单、迅速和高敏感性的检测细胞活性与生长增殖的方法。其原理为：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的mtt还原为水不溶性的蓝紫色结晶物——甲?，并沉积在细胞中，而死细胞则无此功能。dmso能溶解细胞中的甲?，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量，同时也可计算细胞相对增值率（rgr）或抑制率。本实验结果表明，川楝子醇提物有明显的促进肝细胞生长增殖作用。rgr与药物毒性级别的对应关系为：当rgr大于或等于100%时，级别为0级；当rgr在75%~99%时，级别为1级；当rgr在50%~74%时，级别为2级；当rgr在25%~49%时，级别为3级；当rgr在1%~24%时，级别为4级；当细胞无增值率时，级别为5级。本实验结果显示，不同浓度供试品rgr值均高于100%。可见，川楝子醇提物对肝细胞无明显的毒性。参考文献

［1］周继春,杨海燕,徐晓月,何燕.柴胡注射液体外细胞毒性研究［j］.药物分析杂志，2010；30（9）：1809-1812

［2］ 蒋青锋,陈志良,包杰,刘喜荣,武金宝.银杏内酯纳米粒细胞毒性研究［j］.中国医药指南，2010；8（24）：23-25