小议生物人工肾小管的构建

摘要：目的为构建一种既有滤过及抗凝功能、同时又有重吸收及内分泌功能的新型生物人工肾小管提供实验基础。医学论文方法以层黏连蛋白0.74mg/ml包被的AV400滤器为载体，将转染人Nanog基因的血管内皮细胞(ECV304)悬液与转染人Nanog基因的肾小管上皮细胞(HKC)悬液等体积混匀，分次注入实验组滤器内腔，构建生物人工肾小管。对照组只在层黏连蛋白包被的AV400滤器内腔注入不含细胞的培养基。采用PKH26、PKH67标记法分别观察ECV304、HKC在聚砜膜中空纤维上的分布；应用扫描电镜检测混合细胞在聚砜膜中空纤维上的生长状况及形态。结果混合细胞能在聚砜膜中空纤维上较好地黏附、生长。PKH26、PKH67标记检测发现细胞呈致密点片状分布；扫描电镜观察可见细胞形成单层片状。结论两种转染细胞在层黏连蛋白包被的聚砜膜中空纤维上生长良好，这为构建一种既有血管内皮细胞抗凝、同时又有小管上皮细胞重吸收功能的新型生物人工肾小管奠定了实验基础。

关键词：转染基因Nanog内皮细胞上皮细胞混合种植聚砜膜中空纤维肾小管

生物人工肾(bioartificialkidney，BAK)是肾脏组织工程研究的重点之一。BAK的研究包括两个方面：生物人工肾小管和生物人工肾小球。当前，肾脏组织工程研究已取得了极大的进展，但仍存在关键的问题有待解决。如何在一定时间内快速获得大量的组织工程种子细胞；如何让构建的生物人工滤器既有生物人工肾小球的滤过与抗凝功能，同时又有生物人工肾小管的重吸收及内分泌功能。针对如何提高一定时间内种子细胞产量的问题，我们在先前的研究中应用促细胞增殖的人Nanog基因(hNanog)来促进种子细胞的增殖。而对生物人工滤器功能兼备的问题，在本研究中我们采用了种子细胞混合种植的方法。

一、材料与方法

1、材料伊格尔最低浓度必需介质(EMEM)培养基(美国Gibco)，胎牛血清(FCS，美国Hyclone)，胰酶(美国Sig-ma)，PKH26及PKH67(美国Sigma)，Hoechst33342(美国Sigma)。JSM—6000F扫描电镜(日本JEOL公司)。肾小管上皮细胞(HKC)由南京医科大学杨俊伟教授馈赠，血管内皮细胞(ECV304)由军事医学科学院三所细胞室赠送，转染种子细胞的rAAV2-hNanog重组病毒由北京本元正阳生物技术公司包装完成，转染rAAV2-hNanog重组病毒的2种细胞ECV304、HKC由本实验室制备并保存。

2、中空纤维上混合细胞的分布

2.1混合细胞的PKH26/PKH67标记：将转染hNanog基因的两种细胞ECV304及HKC细胞各接种在75cm塑料培养瓶中，置于37℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中，用10%的FCSEMEM进行培养。当两种细胞各生长至汇合时，用0.25%的胰酶消化、离心并沉淀细胞后，然后再用无血清的EMEM洗涤细胞，400g/min离心，共5min，然后弃去上清，使残留上清不要超过25μl，然后在获得的细胞沉淀中加入1ml稀释剂C溶液，轻轻吹打形成细胞悬液；按照PKH26和PKH67试剂盒说明书分别配制4×10-6mol/L的PKH26溶液和4×10-6mol/L的PKH67溶液，然后把ECV304细胞悬液加入到PKH26染液、HKC细胞加入到PKH67染液中，各自吹打均匀，并于室温下放置2～5min。之后加入2ml血清，室温下放置1min，再用10%EMEM4ml稀释上述细胞悬液，25℃条件下1200r/min离心，共10min，弃去上清，去除染色液。用10%EMEM冲洗ECV304、HKC细胞4次，然后将细胞移到另一新管中，加入10ml完全培养基，离心，重悬，使两种细胞各自的密度调整在(1.0～2.0)×107/ml，然后把两种转染细胞ECV304与HKC细胞悬液等体积混合，轻轻吹打均匀，制成混合细胞悬液。

2.2标记细胞的种植：将实验组及对照组的AV400滤器(Fresenius公司0.7m2)均用无血清的EMEM培养基冲洗，再把无血清EMEM配制的层黏连蛋白0.74mg/ml[1]注入滤器中，置于37℃孵箱中1h，之后将其抽去。然后把标记的种子细胞混合液平均分成4次注入滤器内腔，两次注射时间间隔为1h，每次注射完毕后按方向标记放置滤器，待下次注射结束后依照固定方向将滤器转动90°，总共进行4次，完成360°循环。对照组只在AV400滤器中注入不含细胞的培养基，注射方法及放置方法同实验组。最后把两组滤器的外腔注满培养基，置于37℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中培养，滤器中培养液pH<7.2时即予以更换。于培养第5天时从两组滤器中取出中空纤维，用刀片将纤维丝纵向剖开，磷酸盐缓冲液(PBS)溶液冲洗2次，然后在荧光显微镜下观察2种转染细胞在中空纤维上的分布。

3、混合细胞在中空纤维上生长状态的观察把2种已转染人Nanog基因的ECV304、HKC置于37℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中，用10%FCSEMEM进行培养。当两种细胞生长至汇合状态时，用0.25%的胰酶消化，并对2种种子细胞进行细胞计数。实验组及对照组所用AV400滤器仍用层黏连蛋白包被。把2种转染细胞的密度调至(1.0～2.0)×107/ml，然后把两者等体积混合，轻轻吹打均匀，制成混合细胞悬液，然后把细胞混悬液注入滤器内腔，注射方法与放置方法同2.2部分。对照组只在AV400滤器中注入不含细胞的培养基，注射方法及放置方法同实验组。最后将两组滤器外腔注满培养液，置于37℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中培养，滤器中培养液pH<7.2时即予以置换。第7天时从两组滤器中取出中空纤维，用0.1mol/LPBS冲洗1次，然后再用2.5%戊二醛于4℃冰箱中固定2h，之后再用0.1mol/LPBS溶液冲洗，用刀片将中空纤维沿纵向剖开，再用0.1mol/LPBS溶液冲洗2次，最后把剖开的中空纤维置于1%锇酸中，4℃冰箱中固定1h。标本制作完成后，进行扫描电镜检测。

二、结果

1、中空纤维上混合细胞PKH26及PKH67标记检测：经PKH26染色的ECV304转染细胞及经PKH67染色的HKC转染细胞混合种植于聚砜膜中空纤维上后，可见两种种子细胞呈点片状分布在聚砜膜中空纤维上。荧光显微镜下，ECV304细胞呈现红色，而HKC呈现黄绿色。而对照组则无红色或黄绿色的点片状细胞群分布。

2、中空纤维上混合细胞的生长形态：转染的ECV304细胞与转染的HKC细胞混合种植于聚砜膜中空纤维内腔7d后，扫描电镜检测：对照组未见细胞生长；混合细胞在中空纤维内腔上呈片状生长，并可见细胞表面的微绒毛。

三、讨论

早期的肾脏组织工程主要是模仿肾小球的滤过功能，人们利用具有类似肾小球滤过功能的生物膜(如聚砜膜)建立了血液透析的方法。然而，血滤器在血透过程中易出现血栓，最终导致滤过功能下降。为解决血滤器中出现血栓的问题，有人将转染水蛭素基因的内皮细胞种植在生物膜材料上，制成生物人工肾小球[3，4]，但这种具有抗凝功能的生物人工肾小球只能对小分子溶质进行清除和滤过，缺乏物质重吸收及内分泌等重要功能。

生物人工肾小管是把肾小管上皮细胞种植在中空纤维腔内，上皮细胞在中空纤维内腔的表面黏附生长并形成单层，从而发挥小管上皮内分泌、重吸收作用[4-8]，但它缺乏抗凝的功能。在透析过程中，生物人工肾小管仍需要使用肝素抗凝。对血透患者来说，长期使用普通肝素(UFH)可引起脂质代谢异常，加重患者的脂质代谢紊乱[9，10]。尽管有研究认为，血透过程中使用低相对分子质量肝素(LMWH)在一定程度上可以缓解高脂血症和改善脂质代谢，但John等[11]的研究证明，无论使用UFH还是LMWH，均有导致严重的肝素诱发性血小板减少症的可能(heparin-in-ducedthrombocytopenia，HIT)。因此，把两种种子细胞混合种植在聚砜膜中空纤维上，构建一种兼备血管内皮细胞抗凝功能、小管上皮细胞内分泌及重吸收功能的新型生物人工肾小管，是克服既往生物人工肾小球/肾小管不足的一个可行的方法。

我们的研究发现，两种种子细胞混合后，能在聚砜膜材料上较好地生长，证明利用混合种子细胞构建新型生物人工肾小管是可行的。同时，两种种子细胞混合种植，有可能使构建的新型生物人工小管更符合生理结构。Noishiki等把内皮细胞与平滑肌细胞混合种植在人工血管腔面，置于体内血流环境中，结果形成了与血管壁类似的结构。另外，混合种植的2种种子细胞之间还会发生相互作用，而这种相互作用可能是种子细胞持久、良好地黏附生长所必须的。有研究证明，与内皮细胞共培养的平滑肌细胞和单独培养的平滑肌细胞相比较，共培养条件下的平滑肌细胞增殖速度明显加快，蛋白合成量显著增加。当然，内皮细胞与肾小管上皮细胞间是否确实存在这种相互作用，有待今后进一步研究。

近年来，随着新材料与新技术的发展，生物人工肾出现了小型化、可移植化的趋势。Fissell等利用微机电系统(MEMS)技术，把人皮质小管上皮细胞种植在缩微化的硅片及纳米硅微孔膜上，为生物人工肾系统的缩微化提供了一条新途径。此外，当前的生物器官打印技术更为生物人工肾的微型化、可移植化及功能的复合化展现了美丽的前景，但上述技术存在诸多难点，在实际应用中尚有极大困难。因此，利用混合工程种子细胞构建具有复合功能的新型生物人工肾小管具有潜在的应用价值。