缺氧诱导因子2α和胸苷磷酸化酶在肾透明细胞癌中的表达及意义

[摘要] 目的 探讨肾透明细胞癌中胸苷酸磷酸化酶（TP）和缺氧诱导因子2α（HIF-2α）的表达水平与临床病理指标及预后的关系。 方法 采用免疫组化技术检测43例肾透明细胞癌组织中TP和HIF-2α的表达。 结果 TP和HIF-2α主要表达在肾透明细胞癌肿瘤细胞胞核中。TP在43例肿瘤组织均有表达，TP的表达和肾透明细胞癌的a分期、远处转移和微血管密度有关（P0.05）。HIF-2α阳性表达21例，阳性表达率为48.84%。HIF-2α的阳性表达与肾透明细胞癌的远处转移有关（P0.05）。TP和HIF-2α表达呈正相关（r=0.837，P

[关键词] 肾透明细胞癌；缺氧诱导因子2α；胸苷酸磷酸化酶；微血管密度

[中图分类号] R73 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）18-37-03

新生血管生长是肿瘤生长代谢所必需的一个因素。肿瘤细胞通过直接分泌血管生成因子或通过激活并释放贮存于细胞外基质内的血管生成复合物刺激血管生成。胸苷酸磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TP）和缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）在体内显示有重要的新生血管活性。人肾细胞癌（RCC）血运丰富，因此肾细胞癌中一些肿瘤相关的血管生成因子可能参与了肿瘤的生物学行为。本研究通过检测肾透明细胞癌中TP和HIF-2α的表达，研究这两种血管生长因子和临床病理特征以及微血管密度的相关性，以探讨TP和HIF-2α在肾细胞癌侵袭和转移中的作用。

1 材料和方法

1.1 组织标本

取2010～2012年郑州大学第一附属院泌尿外科手术切除的43例肾透明细胞癌组织。其中，男29例，女14例，年龄34～69岁，平均年龄47.2岁。所有组织均经10%的多聚甲醛固定，石蜡包埋，4μm连续切片，备用。正常肾组织石蜡标本9例作为对照组。

1.2 主要试剂

即用型鼠抗人TP单克隆抗体，即用型鼠抗人CD34单克隆抗体和鼠抗链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（SP）试剂盒为福州迈新公司产品，浓缩型鼠抗人HIF-2α单克隆抗体（sc-13596）为美国Santa Cruz公司产品。

1.3 实验方法

采用SP免疫组织化学方法，按照说明书程序进行操作。石蜡切片常规脱蜡，脱水，双蒸水冲洗3min，抗原修复采用高压抗原修复法，滴加3%H2O2 20min，后用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次，每次3min，加正常封闭血清25min，分别滴

加TP、CD34和HIF-2α（1︰50）一抗，4℃过夜，室温平衡后用PBS冲洗3次，每次3min，再滴加生物素标记的二抗，室温孵育20min，PBS洗3次，每次3min，最后，每张切片加三抗溶液，室温孵育20min，PBS洗3次，每次3min，二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木素复染（HIF-2α未复染），0.1%盐酸乙醇分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。用已知乳腺癌阳性切片作阳性对照，用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判定

采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统（同济医科大学千屏影像工程公司），检测阳性染色的数量及其平均光密度值（mean optical density，MOD）。TP和HIF-2α阳性染色为棕黄色颗粒，定位于肾癌透明细胞或颗粒细胞胞核。以CD34在200倍镜下检测计算微血管密度（microvessel density，MVD）。评估微血管密度，将CD34染色的切片置于低倍镜下（×40）观察，确认血管数最高的区域。每个肿瘤标本中，选择最高密度的区域在×200高倍镜下计数。伴或不伴有内腔的单个内皮细胞或内皮细胞群均被认为是单独的血管。微血管密度分为3个等级：Ⅰ级，每个视野0～50个微血管，Ⅱ级每个视野51～100个微血管，Ⅲ级，每个视野>100个微血管。

1.5 统计学方法

利用SPSS10.0统计软件包完成统计分析，平均光密度值用（）表示。病理指标组间采用两独立样本t检验；微血管密度组间采用单因素方差分析；TP和HIF-2α指标间采用直线相关分析。P

2 结果

2.1 肾透明细胞癌中MVD

组织切片中内皮细胞均由CD34抗体显示为棕黄色来反映MVD。其中Ⅰ级9例，Ⅱ级15例，Ⅲ级19例。

2.2 TP在肾透明细胞癌中的表达

43例肾透明细胞癌中TP全部有阳性表达，表现为肿瘤细胞胞核呈棕黄色颗粒，部分细胞胞质内也出现棕黄色颗粒，背景和对照组细胞核均未染色。统计学分析显示TP的表达和肾细胞癌的分期、远处转移和微血管密度有关（P0.05）。TP在肾透明细胞癌中阳性染色MOD值见表1。

2.3 HIF-2α在肾透明细胞癌中的表达

43例肾透明细胞癌中HIF-2α阳性表达21例，阴性22例，阳性表达率为48.84%。阳性表达表现为肿瘤细胞胞核呈棕黄色颗粒，细胞胞质内未见棕黄色颗粒。对照组细胞核未染色。HIF-2α的阳性表达与肾透明细胞癌的远处转移有关（P0.05）。HIF-2α在肾透明细胞癌中阳性染色MOD值见表1。

2.4 肾透明细胞癌中TP表达与HIF-2α表达的关系

43例TP阳性表达标本中HIF-2α阳性表达21例，对比这21例病例中TP和HIF-2α的阳性表达平均光密度值和表达位置发现HIF-2α大片着色的组织同时伴有TP的高表达，两指标阳性表达平均光密度值具有一定线性相关趋势。通过对MOD值的相关分析显示TP和HIF-2α的表达呈正相关（r=0.837，P

3 讨论

胸苷酸磷酸化酶是嘧啶核苷代谢过程中的一个重要酶，有促进内皮细胞的趋药性和血管生长活性。研究显示TP在结肠癌，肝癌，胃癌等多种肿瘤组织有表达[1]，但表达的部位却不尽相同，存有争议。对结肠癌的免疫组化研究报道TP在肿瘤细胞胞浆中表达[2]，另一些研究显示是大部分间质细胞尤其是肿瘤相关巨噬细胞和淋巴细胞而非癌细胞表达TP[3-4]。目前对于TP在肾透明细胞癌中的表达情况研究不多，Mizutani等[5]利用色谱分析法证实肾细胞癌中同正常肾组织相比较TP有更高的活性但未说明TP蛋白具体的表达位置。本研究显示TP蛋白在肾透明细胞癌中主要集中表达在细胞核，部分细胞胞质中也有表达。这同TP蛋白在其他肿瘤中的表达定位有一定的差别说明肿瘤间存在表达部位的异质性。有关肾细胞癌中TP的表达和分期，分级以及浸润转移相关性研究显示TP可以作为一个独立的预后因素[5-6]。本研究结果显示TP的表达和肿瘤的分期，远处转移，微血管密度有关，和淋巴转移无关，提示TP的高表达对肾癌患者的预后有指导意义。

在实体肿瘤中，由于肿瘤细胞增生迅速造成肿瘤微环境始终处于相对缺氧状态，缺氧作为一种应激反应还可诱导肿瘤细胞表达血管内皮生长因子[7]。缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）即是其中重要的一类。相对于HIF-1α，HIF-2α在肾癌中更为重要，是HIF-2α而非HIF-1α转变了VHL的肿瘤抑制功能，促进了肾癌的发展[8]。目前对HIF-2α蛋白在肾细胞癌中的表达情况研究甚少。Kim等报道在肾透明细胞癌中的HIF-2α的阳性表达率较HIF-1α更高，在检测12个例病例中均有表达，主要表达在肿瘤细胞胞质内[9]。在本研究中HIF-2α的阳性表达率为48.84%（21/43），主要表达在肿瘤细胞胞核，并且HIF-2α的阳性表达与肾透明细胞癌的远处转移有关（P0.05）。肿瘤细胞的失控性生长、高代谢状态使绝大多数肿瘤均存在缺氧因素，形成多血管体系是肿瘤细胞适应缺氧的一个策略，HIF可能在这些过程中发挥了非常重要的作用。虽然本研究中发现HIF-2α的表达与MVD尚无直接联系，但是在HIF-2α大片着色组织中同时伴有TP的高表达。TP和血小板源性的内皮生长因子（platelet-derived endothelial-cell growth factor，PD-ECGF）具有完全相同的氨基酸序列，在体内有促血管生成作用[10]。TP的血管生长活性使其的高表达和肾透明细胞癌组织内的微血管密度相互联系，并且缺氧和高糖的微环境可以同时促进TP的表达。这提示HIF-2α和TP的表达存在一定的联系。Sivridis等[11]研究发现在子宫内膜癌中HIF-2α的表达和TP表达相联系是其上游调控因子。本研究认为在缺氧的微环境下HIF-2α和TP共同参与肿瘤的形成丰富血管网不仅为癌细胞的生长提供氧和营养，而且为癌转移提供途径。Wu等[12]研究发现在非小细胞肺癌中HIF-2α的高表达和TP等血管生成因子存在一定联系。本研究也证实两者的高表达和肾透明细胞癌的远处转移有一定联系。HIF-2α通过调控下游靶基因的表达参与了肾透明细胞癌的浸润转移，但HIF-2α诱导TP表达的具体机制需要更为详细的研究。

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（收稿日期：2013-06-09）