探讨细胞色素b5蛋白提取和纯化的综合化学教学实验

随着经济的进步和社会的不断发展，极大的促进了生命科学的发展，也相应的促进了化学和生命科学的交叉与融合.在这种条件下，化学生物学顺时而生.其主要研究内容是科学合理的使用化学相关理论、研究方法以及实验技术，从而通过对小分子的作用来有效的分析和研究生命过程的机制，来掌握和了解蛋白质在生命过程中的重要功能.通过学科发展趋势可以显示，学生在日后的工作和研究里能够拥有较多的机会去接触和了解各种性质的蛋白质以及各种蛋白质的提取与纯化.根据上述情况，本文详细的探讨了和分析了细胞色素b5蛋白提取和纯化的综合化学教学实验，使其能够有效的指引学生加强对相关知识的掌握和理解.

一、细胞色素b5蛋白提取和纯化的综合化学教学实验的实验原理

众所周知，作为生物体内非常重要的氧化还原蛋白――细胞色素b5 （Cyt b5 ），其主要组成成分是肽链和一个血红素b辅基.在现实生活中，其可以通过对血红素辅基中铁离子价态的可逆变化，来完成传递电子的生理功能.对这种蛋白较早的研究是从动物脏器中里提取出细胞色素b5蛋白.

随着经济的进步和社会的不断发展，也促进了蛋白质工程技术的发展，科学家通常使用酶学方法把异源基因克隆到载体质粒，之后再将已经形成的重组子来转入到受体细胞之内，从而使得异源基因能够在受体细胞内得到复制并且得到描述.在本项实验中，有效的合成了牛肝微粒体细胞色素b5 ，并且将其的水溶性结构域的基因同pUC19的质粒采取了体外重组的方式，从而把其放入到宿主菌E.Coli.JM83里，以此来进行科学合理的表达.通过收集所得到的菌体经过破菌、硫酸铵盐析、DEAE-DE52阴离子交换柱分离以及G-75凝胶色谱柱分离等一系列纯化过程，最后获得纯的细胞色素b5水溶性结构域蛋白.

众所周知，对细胞色素b5特定的三维空间折叠其重要作用的是蛋白肽链的氨基酸顺序，具体而言，是将血红素b5 辅基分别插入四个α-螺旋所组成的疏水袋之中，从而有效的稳定了分子的空间构象.

二、细胞色素b5蛋白提取和纯化的综合化学教学实验的实验方法

第一，把EColi.JM83单菌落（含有Cytb5基因）接种到4mL LB培养基中，在37摄氏度的摇床中震摇过夜.把1%的过夜菌接种到1LSB培养基里，在37摄氏度里以震摇的方式培养36小时.从而使得所有培养基都能包含每毫升50克的氨苄青霉素.

第二，在4摄氏度，5000转/min的离心15min进行菌体收集.把收集到的红色菌体放入烧杯里，再通过将每克的湿菌体用3到4毫升的缓冲液进行重悬之后，超声破菌为四小时.破菌液在4摄氏度、12000转/min的条件下离心15min，最后进行红色上清液的收集.

第三，在上清液里面添加固体硫酸铵，从而使其饱和度能够达到百分之七十之上，放到4摄氏度的冰箱里，均匀搅拌3小时之后后进行离心分离，最后进行红色上清液的收集，并且透析重蒸水.

三、细胞色素b5蛋白提取和纯化的综合化学教学实验的结果处理

细胞色素b5在浓度不同的盐酸胍中的变性反应平衡常数，可以通过下列算式进行计算： K=（Ah-A）/（a-An），其中A代表着蛋白溶液在412nm处的吸光度，Ah则代表着当盐酸胍浓度为0时，其溶液在未变形条件下的吸光度.An则代表着盐酸胍浓度为5.6mol/L时溶液在蛋白完全变形时的吸光度.在这种条件下可以使用相似的方法来进行荧光光谱的测量和处理：K=（F-Fh）/（F-F）.

四、结束语

该实验已经在一些本科教学中得到了具体的应用，赢得了学生的广泛欢迎和好评.学生们纷纷表示这项实验帮助他们了解和涉足了一个全新的领域，一方面能够有效的理解和掌握一些蛋白的具体性质，另一方面还可以熟练地掌握相关的原理与基本操作，从而为其今后在学位论文的工作中打下了坚实的基础.