少腹逐瘀汤含药血清对子宫内膜异位症在位内膜分泌IL-8的影响

【摘要】 目的：研究少腹逐瘀汤含药血清对子宫内膜异位症在位内膜分泌IL-8的影响。方法：实验分为少腹逐瘀汤含药血清高剂量组、低剂量组及空白对照组。收集接收手术治疗的子宫内膜异位症病人的在位子宫内膜组织，经体外分离、培养,以实时荧光定量PCR分析不同浓度少腹逐瘀汤含药血清对在位内膜细胞表达IL-8的影响。结果: 少腹逐瘀汤含药血清能剂量依赖性抑制在位内膜细胞表达IL-8。结论: 少腹逐瘀汤含药血清可抑制体外培养的子宫内膜异位症在位内膜细1胞IL-8的分泌,提示少腹逐瘀汤对于治疗子宫内膜异位症可能具有一定的作用。

【关键词】 子宫内膜异位症;在位内膜;少腹逐瘀汤; IL-8

子宫内膜异位症(endometriosis EMS)是一种常见的妇科疾病,主要指子宫内膜在子宫腔被覆面以外的地方种植生长,是一种具有侵袭性的良性病变。EMS在育龄妇女中发病率约 15%左右,在不孕妇女中高达50% ,其发生机制可能与体腔上皮化生学、激素、免疫、环境、遗传学说等因素相关[ 1, 2 ]。细胞因子主要由巨噬细胞、淋巴细胞分泌，是一相关网络，多种细胞因子相互促进子宫内膜异位症的发生。IL-8可促进子宫内膜细胞增殖、粘连 ,导致盆腔粘连、纤维[3]。IL-8还可增加子宫内膜基质细胞中基质金属蛋白酶(matrix metallo proteinases, MMP)的活性和浸润能力, MMP是调控细胞外基质降解和重建的一种蛋白水解酶,可使随经血逆流入腹腔的内膜碎片具有较强的种植侵袭能力,在内膜异位症的发病中发挥作用 [4]。子宫在位内膜中IL-8的异常表达也逐渐为人们所关注,能否通过药物干预抑制在位内膜的IL-8的异常表达,从而阻断或减弱异位种植的倾向。本研究通过体外实验,探讨少腹逐瘀汤对在位内膜IL-8表达的影响。

1 材料和方法

1.1 研究对象及标本采集 原代培养的子宫内膜取自2007年7月至2010年7月在黑龙江中医药大学附属第二医院因子宫肌腺症伴盆腔子宫内膜异位症行子宫切除标本，年龄25-49岁，术前6个月未用激素治疗，子宫切除后立即进行内膜组织的刮取。

1.2 方法

1.2.1 子宫内膜细胞原代培养和传代:参照Ryan等[5]方法,略有改动。将得到的子宫内膜细胞接种于预先放置无菌玻片的6孔板和细胞培养瓶中,培养液用含10%胎牛血清的DMEM /F12培养液(GIB-COL BRL产品),置于37℃、5%CO2细胞培养箱中,每天观察培养细胞的生长情况,待细胞融合成片后用0.25%胰酶消化传代。

1.2.2 不同浓度少腹逐瘀汤对子宫内膜细胞IL-8的影响将子宫内膜细胞接种于24孔板内,培养3天后加少腹逐瘀汤含药血清浓度分别为4%，8%,设不加少腹逐瘀汤含药血清的细胞组作为对照。每组6孔,于加药后72h检测IL-8。

1.2.3 处理好的子宫内膜间质细胞弃去培养基，PBS洗涤后，加Trizol提取总RNA。总RNA用DNaseⅠ消化处理后，采用逆转录试剂盒(TAKARA公司)将1μg纯化的RNA逆转录合成cDNA。取反转录产物1μL，稀释成10μL，作为反应的模板进行PCR扩增。实时荧光定量PCR采用从TaKaRa公司购自的SYBR Premix EX TaqTM，OPTICON2实时荧光定量PCR仪（MJ ResearchR）上进行。检测中以对照组、少腹逐瘀汤含药血清高剂量组、低剂量组cDNA为模板，分别扩增IL-8 基因及内参基因GAPDH（引物序列见表1）。每个反应均设3次重复。反应条件：预变性95℃30s 热循环95℃5 s，58℃20 s（共40个循环）。循环结果后，完成融解曲线，以检验PCR产物的纯度。通过计算2-Ct值来确定该基因在不同浓度药物处理下的相对表达量。

表1 目标基因及内标基因GAPDH荧光定量PCR引

1.3 统计学方法 统计学处理 计量资料数据用x±s表示,两组资料间的均数比较分析用t检验。

2 结果

少腹逐瘀汤含药血清对细胞IL-8表达的影响:对各浓度处理的细胞总RNA进行逆转录以及实时荧光定量PCR,分析药物对细胞内IL-8mRNA的影响,计算少腹逐瘀汤含药血清处理各组相对于对照组的IL-8mRNA表达水平,可见少腹逐瘀汤含药血清对IL-8mRNA的表达呈剂量依赖性抑制作用（P

3 讨论

近年来研究发现,子宫内膜异位症患者血中的免疫异常是继发于细胞免疫功能缺陷。越来越多的证据表明,细胞因子在子宫内膜异位症的形成、发展中起重要作用。来源于活化巨噬细胞的IL-8是一种增强生血管活性的细胞因子，新生血管的形成可促进异位内膜的增殖和浸润入腹膜组织内。同时，IL-8对炎症嗜中性细胞及单核细胞有高度趋化性，有助于炎性细胞在EM病灶的积聚，促使内异灶炎性反应和粘连形成。IL-8以促进血管形成和参与炎症反应在EM的发病中起双重作用。

少腹逐瘀汤源于清代王清任的《医林改错》,具有,温经散寒、理气止痛,并引诸药直达少腹的功用,是临床上治疗子宫内膜异位症的常用方。为探讨该方治疗子宫内膜异位症的机理，本实验通过观察少腹逐瘀汤含药血清对子宫内膜异位症在位内膜细胞分泌的IL-8的作用，结果发现少腹逐瘀汤能明显抑制在位内膜细胞IL-8的分泌，提示该方可能是通过调节细胞因子的异常表达而达到治疗子宫内膜异位症的目的。

参考文献

[1]Vasquez J, Bastias C, MinkMB. Techniques of Treatment of Peritoneal Endometriosis : The Cavitational Ultrasonic Surgical As pirator[J]. Surg Technol I nt . 1998,V II : 263.

[2]DmowskiWP, Gebel H, Braun DP . Decreased apoptosis and sensitivity t o macrophage mediated cytolysis of endometrial cells in endometriosis[J]. Hum Rep rod Update . 1998 , 4 (5) : 696.

[3]Aricai. Local cytokines in endometrial tissue: the role of interleukin-8 in the Pathogenesis of endometriosis .Ann NY A cad sei,2002,955:101-109

[4]Mulayim N ,Savlu A ,Guzeloglu- Kayiali O ,etal .Regulation of endometrial stromal cell matrix metallo Proteinase activity and invasiveness by interieukin-8 . Fertil Steril, 2004, 81( Su PPl l) :904-911

[5]Ryan IP, Schriock ED, Taylor RN.Isolation, characterization, and comparison of human endometrial and endomtriosis cells in vitro.) Clin Endocrinol Metab,1994, 78:642-649.

作者简介：杨东霞 (1977-) ,副主任医师,中医妇科学博士,研究方向：中医药治疗子宫内膜异位症的研究

通讯作者：匡海学(1955-), 教授，博士生导师，研究方向：中药及复方的药效物质基础研究

基金项目：黑龙江省博士后基金资助项目（ LBH-Z07011）; 黑龙江省中医管理局基金资助项目（ZHY10―Z38，ZHY10-W26）