丹参药材水溶性成分含量的HPLC法分析

作者：李曼玲,冯伟红,康 琛,梁日欣,杨洪军,何希荣,黄璐琦

【摘要】 目的 建立丹参药材水溶性成分中丹酚酸b、丹参素和原儿茶醛的含量测定方法。方法 采用高效液相色谱法测定,色谱柱为kromosil c18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相ⅰ：甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59),流动相ⅱ：甲醇-冰醋酸-水(20∶1∶80)；流速：1.0 ml/min；检测波长分别为286、280 nm；柱温35 ℃。结果 测定了10个不同产地的丹参药材,丹酚酸b含量在0.09%～6.81%之间,平均回收率为99.64%,rsd＝1.09%；丹参素的含量在0.16%～0.68%之间,平均回收率为98.94%,rsd＝1.49%；原儿茶醛的含量在0.01%～0.09%之间,平均回收率为98.96%, rsd＝1.66%。结论 本法简便、准确、重复性好,可作为丹参药材的含量测定标准。

【关键词】 丹参；丹酚酸b；丹参素；原儿茶醛；高效液相色谱法

key words：salvia miltiorrhiza bge.；salvianolic acid b；danshensu；protocatechuic aldehyde；hplc

丹参为唇形科植物丹参salvia miltiorrhiza bge.的干燥根及根茎,味苦,性微寒,归心、肝经,具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的作用。用于月经不调,经闭通经,?瘕积聚,胸腹刺痛,热痹疼痛,疮疡肿痛,心绞痛等。丹参的主要药效成分之一是丹参中的水溶性成分,主要是酚酸类化合物丹酚酸b、丹参素和原儿茶醛。我们采用hplc法建立了这3种成分的含量测定方法,可用于丹参及其饮片和制剂的研究及质量控制等。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪：hp1100高效液相色谱仪,g1315a dad检测器,g1311a四元泵,g1313a自动进样器,g1316a柱温箱,g1322a在线脱气机,agilent chemstation色谱工作站。丹酚酸b对照品(批号200201)、丹参素钠对照品(批号855-200102)、原儿茶醛对照品(批号0801-9402)均为供含量测定用,购于中国药品生物制品检定所。乙腈：色谱纯,美国；甲醇：色谱纯,北京化工厂；高纯水：自制；其他试剂均为分析纯。丹参药材由本所生药室提供。

2 方法与结果

2.1 丹酚酸b的含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱：kromasil c18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相：甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)；流速：1 ml/min；柱温：35 ℃；检测波长λs＝286 nm；理论板数按丹酚酸b峰计算应不低于4 000。在此条件下丹酚酸 b与其他组分达到良好分离(见图1)。

2.1.2 供试品溶液的制备

取本品粉末(过3号筛)0.2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入75%甲醇50 ml,密塞,称定重量,加热回流1 h,取出,放冷,再称定重量,用75%甲醇补足减失的重量,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取续滤液,即得。

2.1.3 对照品溶液的制备

取丹酚酸b对照品适量,加75%甲醇溶解并制成每1 ml含0.14 mg的溶液,即得。

2.1.4 标准曲线的绘制

分别精密吸取对照品溶液(0.14 mg/ml) 4、8、12、16、20 μl,注入高效液相色谱仪,测定峰面积。以丹酚酸b的进样量为横坐标,以峰面积的积分值为纵坐标,绘制标准曲线,并计算回归方程：y＝-0.153 6＋895.6x,r＝0.999 6,结果表明,丹酚酸b在0.56～2.8 μg范围内呈线性关系。

2.1.5 精密度试验

取供试品溶液1份,在上述色谱条件下连续进样5次,每次进样5 μl,测定丹酚酸b含量,经计算,rsd＝0.28%。

2.1.6 重复性试验

平行制备5份供试品溶液,分别在上述同一色谱条件下,分别进样5 μl,测定丹酚酸b含量,经计算, rsd＝2.24%。

2.1.7 稳定性试验

取供试品溶液1份,上述色谱条件下,分别于样品制备后第0、1、2、4、8、16、24 h进行测定,测定丹酚酸b含量,经计算,rsd＝1.76%。

2.1.8 加样回收率试验

取已知含量的丹参药材粉末,分别加入等量的丹酚酸b对照品,按上述色谱条件测定,计算回收率,丹酚酸b为99.64%,rsd＝1.09%。见表1。表1 丹酚酸b回收率试验结果（略）

2.1.9 含量测定

按供试品溶液制备方法,分别对10个不同来源丹参药材丹酚酸b的含量进行测定。结果见表2。表2 不同产地丹参药材丹酚酸b的含量测定结果（略）

2.2 丹参素和原儿茶醛的含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：kromasil c18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相：甲醇-冰醋酸-水(20∶1∶80)；流速：1 ml/min；柱温：35 ℃；检测波长λs＝280 nm。理论板数按丹参素峰计算应不低于4 000。在此条件下,丹参素、原儿茶醛与其他组分达到良好分离(见图2)。

2.2.2 供试品溶液的制备

取丹参药材粉末(过3号筛)约0.2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入水25 ml,密塞,称定重量,超声提取1 h,取出,再加热回流4 h,取出,密塞,再称定重量,用水补足减失的重量,摇匀,滤过。取续滤液,即得。

2.2.3 对照品溶液的制备

精密称取丹参素钠、原儿茶醛对照品适量,分别加甲醇溶解,并制成每1 ml分别含丹参素钠0.08 mg(相当于丹参素0.07 mg)、原儿茶醛0.012 mg的溶液,即得。

2.2.4 标准曲线的绘制

分别精密吸取丹参素钠对照品溶液(0.08 mg/ml)和原儿茶醛对照品溶液(0.012 mg/ml)各3、6、9、12、15 μl,注入高效液相色谱仪,测定峰面积。以丹参素钠和原儿茶醛的进样量(μg)为横坐标,以峰面积的积分值为纵坐标,绘制标准曲线并计算回归方程。丹参素钠y＝-7.147 2＋406.353x,r＝0.999 1；原儿茶醛y＝-0.772 7＋ 4 943.475x,r＝0.999 2。结果表明,丹参素钠在0.24～1.2 μg范围内呈线性关系；原儿茶醛在0.036～0.18 μg范围内呈线性关系。

2.2.5 精密度试验

取供试品溶液1份,在上述色谱条件下连续进样5次,每次进样5 μl,测定丹参素、原儿茶醛含量,经计算,丹参素的rsd＝1.26%,原儿茶醛的rsd＝0.86%,二者之和的rsd＝1.13%。

2.2.6 重复性试验

平行制备5份供试品溶液,分别在上述同一色谱条件下,分别进样5 μl,测定丹参素、原儿茶醛含量,经计算,丹参素的rsd＝2.60%,原儿茶醛的rsd＝0.66%,二者之和的rsd＝2.20%。

2.2.7 稳定性试验

取供试品溶液1份,在上述色谱条件下,分别于样品制备后0、1、2、4、8、16、24 h进行测定,测定丹参素、原儿茶醛含量,经计算,丹参素的rsd＝0.58%,原儿茶醛的rsd＝1.47%,二者之和的rsd＝0.58%。

2.2.8 加样回收率试验

取已知含量的丹参药材粉末,分别加入等量的丹参素钠、原儿茶醛对照品,按上述色谱条件测定,二者回收率分别为98.94%和98.96%,rsd分别为1.49%和1.66%(见表3、表4)。表3 丹参素钠回收率试验结果（略）表4 原儿茶醛回收率试验结果（略）

2.2.9 含量测定

按供试品溶液制备方法,分别对10个不同来源丹参药材中的丹参素、原儿茶醛的含量进行测定。结果见表5。表5 不同来源丹参药材中丹参素、原儿茶醛的含量测定结果（略）

3 讨论

在丹酚酸b含量测定中,曾经试用过甲醇-乙腈-甲酸-水不同配比的流动相,结果正文采用的流动相配比分离效果最好,所以最终选择其作为流动相。试验过程中曾对供试品的提取溶媒、溶媒用量、提取方法、提取时间等因素进行了考察,结果表明,正文所列的供试品溶液制备方法为各因素最佳组合。