探讨转录基因的克隆方法

1序列分析

采用VectorNTI11.0进行多序列比对。基于拟南芥、水稻、毛果杨、小立碗藓、番茄衣藻(的SPL蛋白中SBP-domain区氨基酸序列(76aa)，采用MEGA4.0软件(邻接法)进行多序列比较，对光皮桦BlSPL1进行系统进化分析(Tamuraetal．，2007)，所用序列来自数据库。具体的基因名和序列号参考Salinas等(2011)的报道。按照试剂盒说明进行，其扩增反应程序为:95℃5min;95℃5s，60℃20s，72℃20s，40个循环。定量引物为51QF和51QR，内参基因Actin的引物为，采用相对定量分析基因表达。SNP分析鉴于BlSPL1基因组序列较长，为便于克隆和测序，将其分成A和B2段进行克隆、SNP搜寻与分析，其中段包含5''''-UTR部分序列和第1、2个外显子及第1个内含子、第2个内含子部分序列共1665bp，B片段包括第2个内含子部分序列、第3个外显子(含miR156靶位点)以及3''''-UTR共846bp。引物51F433和51R2098用于段的克隆，51F2608和51R用于B片段的克隆。以57个不同种源的无性系植株基因组DNA为模板，采用高保真Pfu酶(北京全式金)进行PCR扩增，PCR扩增产物回收后采用pEASY-BluntcloningKit进行克隆，挑取阳性克隆进行序列测定，每个样本至少挑3个克隆进行测序。利用DnaSP5.0软件(Libradoetal．，2009)对序列进行分析，搜寻SNP位点、计算SNP频率及多样性指数;分析同义突变、错义突变和无义突变情况;分析LD在光皮桦不同群体BlSPL1基因中的延伸模式。

2结果与分析

2.1光皮桦BlSPL1基因的克隆及其序列分析

基于光皮桦转录组序列，利用RACE技术，克隆获得了BlSPL1基因。序列分析结果表明，该基因cDNA序列全长1825bp，分别包含486bp的5''''-UTR，169bp的3''''-UTR，以及长为1170bp开放阅读框，其编码389个氨基酸。用ProtParamtool估算推导的蛋白质的分子量约为42.37kDa，其等电点为8.43。同源分析表明，与桃、苹果(Malus×domestica)MdSPL1(ADL36824.1)的序列同源性最高，分别达到67%和60%。同时，为进行后续的SNP分析，根据cDNA序列克隆了其对应的基因组DNA序列。结果表明BlSPL1的基因组序列全长3457bp，包含2个内含子和3个外显子，第1个内含子长1005bp，第2个内含子为624bp，3个外显子分别长416bp，134bp，620bp，在第3个外显子处含有miR156靶位点。进一步的蛋白结构域分析表明，BlSPL1在蛋白质的第92—170氨基酸残基位置上含有该基因家族所特有SBP结构域，此结构域包含2个锌指结构，其中N端锌指结构(Zn-1)为Cys3His，C端锌指结构，另外在该结构域的C端第150—167位置上含有核定位信号，这与相关报道相符。为分析BlSPL1基因的系统进化关系，参照Salinas等(2011)构建了SBP-box基因家族系统发育进化树。可见，陆地植物SPL蛋白分化为8个分支，即groupⅠ－Ⅷ，而BlSPL1属于groupⅦ这一分支，与来自水稻、拟南芥和杨树的相关SPL蛋白同属一个分支，且与杨树的PtSBP20亲缘关系最近。BlSPL1基因的表达分析SPL基因在植物成花过程中被认为是比较上游的调控因。因此，本研究采用定量PCR对BlSPL1基因在光皮桦芽、雌花、雄花以及幼苗早期不同发育阶段的表达情况进行了分析。可见，BlSPL1基因在光皮桦的芽、雌花、雄花、幼苗中均有表达，但在雄花和幼苗中的表达水平较低，而在芽发育成雌花的过程中其表达逐渐升高B1－B3)，在雌花明显可见时(F1)表达量达到最高，其后表达量又逐渐降低。从这些结果可以初步推测BlSPL1可能在芽发育为雌花的过程中起调控作用。

2.2BlSPL1基因SNP多样性分析

插入和缺失长度在1～3bp之间，其中编码区有一长度为3bp的插入，未导致编码区的移码突变，其余均发生在非编码区。BlSPL1基因内SNP发生的平均频率为1/26bp，在5''''-UTR、外显子、内含子、3''''-UTR分别检测到了2、28、61、7个SNPs，其出现频率为内含子＞3''''-UTR＞5''''-UTR＞外显子。由SNP在BlSPL1基因内部出现的频率可知，该基因不同区域的保守性不同，而在编码区核苷酸变异程度最低，显示了该基因在进化过程中编码区受到了较强的选择压。进一步对检测到的97个SNPs进行了变异类型统计(表3)。结果显示，在这些SNPs中，有57个属于转换类型，分别包含29个AG和28个TC。对于颠换类型，共检测到40个，分别是14个AC、7个TG、11个AT和8个GC，转换/颠换=1.43。为检测BlSPL1编码区SNPs是否引起其编码氨基酸的改变，对编码区内的28个SNPs进行了同义突变、错义突变、无义突变分析。在BlSPL1编码区内的28个SNPs中，11个属于同义突变，17个为错义突变。其在SBPdomain区域内发生了2次同义突变和0次错义突变，而在SBPdomain外的编码区发生了9次同义突变和17次错义突变，如位于编码区的第172和第1974位置上分别发生了第1位和第2位密码子的改变，由AGA突变为GGA，GCA突变为GAA，从而分别导致其编码的氨基酸由精氨酸(Arg)变成甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)变成谷氨酸(Glu)。可知SBPdomain编码区内无错义突变，而SBPdomain以外编码区错义突变频率为1/18aa;又基因的第3个外显子内错义突变达15个，而其区域内的miR156靶位点没有核苷酸突变位点出现。由以上可知SBPdomain和miR156靶位点有很强的保守性。BlSPL1基因在光皮桦不同群体内的遗传分化及变异为了检测BlSPL1基因在光皮桦不同群体内核苷酸变异及群体分化程度，利用DnaSP5.0软件对5个群体分别进行了多态性位点数、单核苷酸多样性、的中性检验。对于检测到的SNP多样性指数πtot、πsil、πs、πn均有差异，但差异不显著，说明BlSPL1在群体间的分化程度并未达到显著水平。Tajima’sD*和FuandLi’sD*中性检验结果表明，D*均为负值，这显示了在光皮桦群体内，BlSPL1基因在进化过程中存在过剩的稀有SNPs，特别是广西群体内存在较多的低频率SNPs。而5个群体，均为πn＜πs，即非同义突变与同义突变的比率＜1，显示出在光皮桦物种演化过程中，纯化选择是BlSPL1基因内同义SNP位点的主要筛选压。

2.3BlSPL1基因内SNPs的连锁不平衡分析

SNPs的LD程度迅速削弱，但不同群体内LD衰退程度明显不同;当R2＜0.1，在黄山东部、武夷山东部、广西、四川、贵州群体中LD衰退序列长度分别达到，其中来自四川的群体LD在该基因组延伸长度最短。这一结果表明，在光皮桦不同天然群体内，BlSPL1基因内SNPs存在不同程度的连锁不平衡，但其连锁不平衡在候选基因内就已衰退。

3讨论

序列分析表明在其第3个外显子处含有miR156靶位点，同时其编码的氨基酸具有典型的SBP-domain，包含2个典型的锌指结构。进一步的系统进化分析表明BlSPL1属于陆地植物SPL蛋白groupⅦ这一分支，且与杨树的PtSBP20、拟南芥AtSPL13等具有较近的亲缘关系，基因组序列分析结果也显示BlSPL1的基因结构与这一分支的同源基因相似，因此这些基因在功能上可能有一定的相似性，但目前这一分支的基因并没有深入的功能研究。同时，系统进化分析显示在每个SPL蛋白分支中都包含至少一个单子叶和双子叶植物的SPL基因(groupⅣ除外)，这表明BlSPL1与其他高等植物的SPL基因可能具有共同的祖先，而在groupⅦ分支中，BlSPL1与同为林木的杨树SPL基因亲缘关系最近，反映了光皮桦与杨树间的亲缘关系，同时也表明随着双子叶植物的分化，其相应的SPL基因可能也在进一步的特化。虽然SPL基因在植物中参与不同的生长发育调控，但目前对功能的研究主要集中于其对开花过程的调控。在模式植物拟南芥中的研究说明，miR156-SPL3是调控植物成花的重要途径。但在林木中，SPL基因的功能和调控机制仍然不明确。由于缺乏可用转基因平台或突变体，目前对木本植物SPL基因功能的研究大多是通过表达分析来进行研究。如对枳的SPL9和SPL13进行了表达分析，发现两者在叶、茎、根、花、果等各个器官均有表达，分别在茎和幼果中表达量最高，推测它们可能分别与茎和果实的发育相关(宋长年等，2010)。BlSPL1基因的表达也具有组成性，在幼苗、芽、雄花和雌花均有表达，在雄花和幼苗中表达水平较低，但在芽发育成雌花的过程中有一个明显的表达水平上调，这些结果暗示BlSPL1与光皮桦的开花相关，且可能在雌花发育过程中起调控作用。

作者：李玉岭周厚君林二培黄华宏徐莉莉童再康单位：浙江农林大学