虾类养殖论文:克氏原螯虾PO的生化特性

时间:2022-06-20 11:19:05

虾类养殖论文:克氏原螯虾PO的生化特性

本文作者:王建国1,2许琴瑟1王权1熊良伟1陆宏达1封琦1朱云干1作者单位:1江苏畜牧兽医职业技术学院2上海海洋大学水产与生命学院

试验结果

1温度对酚氧化酶活力的影响

不同温度下克氏原螯虾鳃组织PO活力变化如图1,血清PO活力变化如图2。鳃组织PO活力大于血清PO,不同温度下鳃组织和血清PO活力变化规律很相似。0~35℃内PO活力均随温度上升逐渐增大,各温度组鳃组织PO活力均存在显著差异(P<0.05),其中血清PO活力除20℃与25℃和25℃与30℃无显著差异外,其余各组间均有显著性差异(P<0.05)。35~45℃之间PO活力逐渐下降,但尚未达到显著差异水平(P>0.05)。当温度高于45℃时PO活力急剧下降,各组间存在显著差异(P<0.05)。温度低于35℃时样品对照组引起的吸光度值较小,高于40℃时吸光度迅速增大,影响测定结果。0℃冰水浴中PO仍具有一定活力,约为25℃时的31%,35℃时的24%。温度低于35℃时底物对照组引起吸光度变化较小,35℃以上随温度升高吸光度逐渐升高,40℃开始吸光度显著高于35℃以下温度组(P<0.05),65℃时吸光度最高,为35℃时的16倍。说明温度过高时底物引起的吸光度变化会干扰PO测定。

2缓冲液pH对酚氧化酶活力的影响

在不同pH环境中鳃组织中PO活力变化如图3。鳃组织中PO在pH5.5时活力最高,除与pH6无显著差异外(P>0.05),均显著高于其它组(P<0.05);pH6时与pH7~10各组间均存在显著性差异(P<0.05)。PO具活力的pH范围为4~9.5,最适pH为5.5~6。结果显示偏酸性缓冲液中PO活力较高。不同pH环境中血清中PO活力变化如图4。血清中PO活力在pH6.5时最高,显著高于其它组(P<0.05)。具活力的pH范围为5.5~8.5,pH为5.5~6和7~8各组间无显著性差异(P>0.05),pH低于5和高于9时活力迅速下降。pH5以下时样品引起吸光度变化较大,pH越低吸光度变化越明显;pH8.5以上时底物L-DOPA会生成红棕色物质,pH越大越明显,对测定干扰较大。以上结果说明pH对血清PO和鳃组织PO的影响存在一定差异。

讨论

1温度对酚氧化酶活力的影响

日本对虾[10]、日本[11]等酚氧化酶与L-DOPA反应的最适温度为40℃,白对虾和斑节对虾[12]最适温度为45℃,南美白对虾[13]最适温度为50℃,中国对虾[5]最适温度为55℃,龙虾[14]的最适温度为30℃,锯缘青蟹[15]最适温度为25℃,朱毅菲等[7]报道克氏原螯虾最适温度为20℃。从以上数据可以看出甲壳动物种类不同其PO最适温度具有较大差异,在20~55℃之间不等,因此在进行PO活力测定中根据品种选用合适的温度条件是非常必要的。在本实验设计的温度范围(0~75℃)内,克氏原螯虾血清和鳃组织中PO的最适温度均为35℃,朱毅菲等[7]的实验结果中温度从20~50℃PO活力是呈下降趋势,最适温度为20℃,这两个结果差异很大。但其未设置温度低于20℃的情况,70淡水渔业2012年在20℃以下PO活力不清楚的情况下判断最适温度为20℃是不严密的。本实验所采用的克氏原螯虾也是暂养在20℃左右,与朱毅菲等的实验结果差异较大。朱毅菲等[7]认为克氏原螯虾血清PO活力在20℃最高的原因是实验用虾处于22℃的水中已适应了此温度环境,在越接近其生活环境的温度下酶活力越高,反应越彻底;而反应温度与螯虾环境温度差异越大,对酚氧化酶造成的破坏越大。日本沼虾[4]、日本对虾[10]、南美白对虾[13]、中国对虾[5]等多种甲壳动物PO最适温度都高于其生活温度,克氏原螯虾适应能力极强,在10~30℃能正常生长发育,因而仅以适应了实验温度解释其最适温度是不可取的。另外朱毅菲等[7]的结果显示当温度达到50℃以上时PO活力会出现升高的现象,其实不是活力真正升高,而是因为当温度升高时样品和底物均会产生较大吸光度所致(如图1,2),所以如果没有设置空白对照扣除这部分差值就会得出50℃以上活力反而升高的结果,因此朱毅菲等[7]计算PO活力的方法也存在不妥之处。笔者认为本实验所得出的克氏原螯虾酚氧化酶最适温度为35℃可靠性更高,而朱毅菲等通过试验得出最适温度为20℃的结果是不够准确的,一方面可能是由于试验本身造成,另一方面可能和所选实验对象的生活环境及地区差异等有关造成。本实验还测定了冰水混合物(0℃)时鳃组织和血清中PO的活力均为最高值的24%左右。许多学者在测定PO活力时均借鉴其他酶活力的测定工艺,使底物与样品反应一段时间后采用冰浴法来终止反应[5-6],这在克氏原螯虾PO活力的测定中是有不妥之处的。冰浴只能在一定程度上减缓反应速度,无法达到和其他酶同等的效果,因此该方法的使用有待学者斟酌。

2缓冲液pH值对酚氧化酶活力的影响

动物体液的pH因种类不同而有一定差异,不同甲壳动物PO最适pH也不完全相同。汪小锋等[16]报道中国对虾最适pH为6.0,杨玲玲等[11]报道日本最适pH为6.0,夏栋等[14]报道龙虾最适pH为6.3,赵丙辰等[13]报道南美白对虾最适pH为6.0,而陈丽娇等[17]报道南美白对虾最适pH为7.0,赵娇等[10]报道日本对虾最适pH为6.5,陆宏达等[8]报道中华绒螯蟹最适pH为6.5,潘清清等[15]报道锯缘青蟹最适pH为7.8,以上报道的经济甲壳类PO最适pH大多在6~8之间,一些昆虫PO最适pH在5.0~9.5。本试验结果显示克氏原螯虾鳃组织PO最适pH为5.5,血清PO最适pH为6.5,与朱毅菲等[7]报道的血清酚氧化酶最适pH为7.0的结果基本相似。克氏原螯虾和大部分甲壳动物相似,在偏酸性的环境中PO活力相对较高。有学者认为偏酸性的环境会影响一些生物的PO活力[18],和许多甲壳动物的研究结果不同,所以不同物种的PO特性具有较大差异。本实验得出的最适pH和朱毅菲等[7]的结果略有差异,赵丙辰和陈丽娇报道的南美白对虾最适pH也存在一定差异,说明不同的生活环境及物种地区差异对PO特性也可能有影响。本实验得出鳃组织PO活力的最佳pH为5.5,血清为6.5,具有一定差异;鳃组织PO活力大于血清PO与其他实验中呈现的结果相似[8],这说明同一物种体内不同部位的酚氧化酶不完全相同。甲壳动物PO的最适温度、pH及激活剂、抑制剂等生化性质存在差异,其酚氧化酶基因也有一定差异,但都具有将酚氧化成醌的共同性质[19],所以PO生化特性受物种差异影响较大,不同物种和不同组织都不能一概而论,具体差异还有待更多学者深入探讨。Pind等[20]报道在测定PO时要尽量中和环境中多余的OH-以减少其和底物L-DOPA发生反应引起吸光度造成测量误差。本实验显示样品在pH值5~8.5的缓冲液中吸光度变化不大,L-DOPA在酸性和中性缓冲液中较稳定,当pH超过8.5时溶液会生成黄棕色物质,出现较大吸光值,pH值越大引起吸光度变化也越大,会干扰测定。因此在PO活性测定中需要设置底物和样品对照,才能使结果更加准确。

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