当归多糖对血管性认知功能障碍大鼠海马细胞凋亡的影响

【摘要】 目的 观察当归多糖（AP）对分期双侧颈总动脉结扎法（2-VO）制作的慢性脑低灌注血管性认知功能障碍（VCI）大鼠模型海马CA1区Bcl-2和Bax的表达的影响。方法 40只Wistar大鼠随机分为假手术组（SO）、模型组（M）、当归多糖A组（APA）（5%）、当归多糖B组（10%）（APB）、尼莫地平组（N）。应用HE染色，免疫组化染色法观察大鼠神经元形态改变和Bcl-2，Bax阳性细胞的表达。结果 SO组大鼠海马CA1区可见少量Bcl-2，Bax阳性细胞表达，M组Bcl-2，Bax阳性细胞数量显著增加（P

【关键词】 血管性认知功能障碍；当归多糖；Bcl-2；Bax

近年来的中药分析研究发现，当归多糖（angelica polysaccharide，AP）有明显的补血活血、免疫促进、抗肿瘤、抗辐射损伤等广泛的药理活性[1]，在疾病的预防和治疗方面具有多途径、多靶点、多环节等优点，具有突出的应用研究价值。但未见AP对慢性低灌注导致的脑功能损害作用的报道。本研究通过观察AP对改良分期双侧颈总动脉结扎（2-VO）法[2]制作的慢性脑低灌注血管性认知功能障碍（vascular cognitive impairment，VCI）大鼠模型海马Bcl-2，Bax蛋白表达的影响，探讨AP对VCI模型大鼠神经细胞凋亡的影响及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级雄性成年Wistar大鼠40只，体重230±20g。实验前大鼠在安静环境下饲养2d，术前禁食12h，不禁水。Bcl-2免疫组化试剂盒和Bax免疫组化试剂盒：武汉博士德生物有限公司；兔超敏二步法免疫组化检测试剂和DAB试剂盒：北京中杉金桥生物有限公司。参照刘娟等[3]的方法，取新鲜岷当归药材（甘肃康达有限责任公司提供），采用超临界CO2萃取法，实验室自制高纯度AP。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 将40只大鼠称重并排序，采用随机数字表法随机抽取8只为假手术组，另外32只大鼠为造模组。模型复制成功后，按随机数字分为模型组、当归多糖A组、当归多糖B组、尼莫地平组，每组8只。

1.2.2 模型制备方法 参照吴章福[2]等的方法，采用改良的分期2-VO制作VCI大鼠模型，10%水合氯醛（0.3ml/100g体重）腹腔注射全身麻醉。术后适量青霉素抗感染，保温，常规饲养。动物苏醒后出现眼睑下垂，眼裂变小说明手术成功[4]。

1.2.3 给药方法 根据动物与人体体表面积折算法，术后第4日开始灌胃给药，共28天。APA组：精密称取冻干AP高纯干品5mg，溶于100ml蒸馏水，配制成浓度为5%的溶液，按照大鼠体重1ml/100g灌胃，每日1次。以同样的方法制备APB溶液，浓度为10%。SO组、M组以等量蒸馏水灌胃，每日1次。N组，以120mg溶于81ml水中，以20mg/kg.d的比例给药，按照大鼠体重1ml/100g灌胃，每日1次。

1.2.4 取材与固定 第29d，迅速断头处死动物，取冠状切取视交叉后10mm至15mm 脑组织，置于4%甲醛溶液中固定24h，梯度酒精脱水，然后放在蒸馏水中漂洗24h。常规石蜡包埋。

1.2.5 显微镜观察及阳性判断 在相同条件下对石蜡切片依次脱蜡脱水进行HE染色并观察组织形态学改变；免疫组化染色观察石蜡切片中Bcl-2和Bax的表达情况。阳性反应产物主要位于细胞浆，免疫阳性细胞质内出现棕黄色颗粒，着色越深阳性反应越强。在400倍光镜下在大鼠海马CA1区随机选择5个视野，做免疫反应阳性细胞数计数，以“个/视野”为单位，结果取5个视野的平均值。

1.3 统计学方法 所有实验数据以均数±标准差（χ±s）表示，采用SPSS16.0统计学软件进行数据统计分析，组间比较采用单因素方差分析。P

2 结 果

2.1 各组大鼠海马组织形态学比较 光镜下观察，SO组大鼠海马区神经元排列规则，胞质丰富，胞核较大。M组大鼠海马区神经元大量变性、死亡，细胞体积缩小，胞浆浓缩、呈现深红色染色，核固缩、碎裂明显、深染。APA和B组，N组与M组相比，海马区神经元变性、死亡明显减轻。海马区神经元胞体缩小，但形状与假手术组接近。而三组之间以APB组大鼠海马CA1区形态与假手术组最接近。本实验HE染色结果表明APA组、APB组及N组对大鼠海马的形态有显著保护作用，且APB组的保护作用为佳，（见图1）。

2.2 各组大鼠海马Bcl-2、Bax的表达 实验结果显示，SO组大鼠海马CA1区，可见少量或无Bcl-2，Bax阳性细胞表达，与SO组相比，M组海马区Bcl-2、Bax阳性细胞数量显著增多（P

SO组：仅有少量或者无免疫阳性细胞，着色浅。M组：免疫阳性细胞数较SO组明显增多，着色加深。N组、AP A组及AP B组免疫阳性细胞数较模型组显著增多，着色较深。

2.4 各组大鼠海马Bax 蛋白表达免疫组化染色 见图3。

3 讨 论

慢性脑缺血是临床常见的病理生理过程，也是VCI的重要病理基础[5]，研究证实，绝大多数VCI患者具有慢性脑低灌注的病史[6-7]。动物研究的结果表明，慢性脑低灌注可明显降低模型动物的认知学习记忆功能[8]。

海马结构属于脑边缘系统中的重要结构，在学习、记忆、认知等高级神经活动中起重要作用，尤其是短期记忆与空间记忆。依据细胞形态、不同皮质区的发育差异以及纤维排列的不同，将海马分为4个区，其中CA1及CA3构成严格意义上的海马。慢性脑缺血缺氧可导致海马锥体细胞数量显著降低，使神经元超微结构发生形态结构上的病理改变，引起神经元凋亡。突触后致密区的shank蛋白、突触外NMDA受体、β淀粉样肽和tau蛋白磷酸化过程中产生的寡聚体均可导致基因性或非基因性的神经元-突触丢失，并进一步导致突触结构破坏，神经递质释放障碍，使突触传递也发生障碍，从而导致学习、记忆和认知能力障碍。实验研究表明，某些药物分子可以抑制脑缺血缺氧造成的海马神经元凋亡或神经元-突触丢失[9-10]。

Bcl-2基因族在细胞凋亡的基因调控过程中有着非常重要的作用[11]，其表达的升高对神经细胞具有保护作用[12-13]，是一种有效的抑制神经元凋亡和坏死的因子，可提高神经元的存活能力，防止神经元丢失，还能促进突触的再生[14-15]。大量研究表明，Bcl-2基因族在VCI大鼠中有显著的表达，可通过与促凋亡蛋白形成Bcl-2/Bax异源二聚体而达到抑制凋亡的目的。Bcl-2基因族调控神经元凋亡的机制是，通过阻断凋亡信号转导系统的前后离子通道，从而抑制细胞的程序性死亡，促进细胞存活[16-18]。

VCI发病时，海马CAl区神经细胞存在细胞凋亡[19-20]。本研究中观察到脑低灌注大鼠模型建立后凋亡细胞阳性表达有显著变化，由此推测AP可能通过抑制Bax表达，促进Bcl-2表达，降低神经元对慢性脑低灌注的敏感性，减少海马神经元的凋亡，防止突触结构破坏，提高VCI大鼠的认知能力。

总之，AP对VCI大鼠海马CA1区神经细胞的保护作用可能是通过上调Bcl-2的表达，相对抑制Bax的表达而实现的。但AP对Bcl-2基因族表达影响的信号转导机制仍有待进一步研究。

参考文献

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