毛细管电泳法检测髓过氧化物酶在急性白血病中的表达

【摘要】 目的 研究髓过氧化物酶（MPO）在各类型急性非淋巴细胞白血病（ANLL）中表达的差异，探讨MPO表达的定量检测在ANLL分型诊断中的意义。方法 采用毛细管电泳(CE)电化学检测法检测36例ANLL患者及30例正常骨髓单个核细胞（BMMNC）中MPO表达。结果 MPO在ANLL中的表达显著高于其在正常对照中的表达（P

【关键词】 急性白血病;髓过氧化物酶;毛细管电泳

白血病（leukemia）是累及造血干细胞的造血系统恶性肿瘤。由于白血病亚型不同，诊断标准也有不同，治疗方案及预后亦不尽相同。所以白血病的分型诊断在临床工作中具有重要的指导意义。髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）被认为是髓系特征中最具特异性的标志,在各型白血病的分型诊断中具有重要意义。目前通过细胞化学染色、流式细胞术［1,2］或电镜［3］对MPO的检测及应用Northen、RTPCR等技术对MPOmRNA的检测已有诸多报道［46］。但以上均为定性检测，对MPO的定量检测尚未见文献报道。本研究采用毛细管电泳法 ( capillary electrophoresis,CE)定量检测MPO在不同类型ANLL中的表达，力争为MPO的检测找到一种更为灵敏的方法。

1 材料和方法

1.1 临床资料

36例初发及复发急性非淋巴细胞白血病（acute nonlymphocytic leukemia,ANLL）患者均来自我院2005年6月至2006年1月门诊及住院病人，其中FAB分类M1 4例、M2 7例、M3 9例、M4 6例、M5 8例和M6 2例，男19例，女17例，年龄15-70岁。全部病例均与化疗前采集骨髓制备标本，并常规进行细胞化学染色。对照组30人，男17人，女13人，年龄22-34岁，均为健康 体检者，经询问病史、体检、实验室及影像学检查无异常者。

1.2 试剂及主要仪器

PBS缓冲液（pH=7.4，武汉博士德生物工程有限公司）；淋巴细胞分离液（密度=1.077，济南爱博有限公司）；过氧化氢（H2O2，含量30%，分析纯，江苏徐州试剂二厂，徐州，江苏）；氢醌（H2Q，分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司）；辣根过氧化物酶（HRP，活性>250 u/mg，上海丽珠东风生物技术有限公司）；弹性石英毛细管（内径25 μm，外径375 μm，河北永年光导纤维厂，河北）；碳纤维（直径6 μm，山东大学碳纤维研究中心，山东）；10412普通台式离心机（上海手术器械厂）；高压电源（9323HVPS，北京市新技术应用研究所，北京）；CHI化学分析仪（CHI800型，CHI仪器公司，Austin,TX,USA）；微型电解池（自制）；三电极体系：碳纤维束微盘电极（工作电极），铂丝电极（辅助电极），饱和甘汞电极（SCE，参比电极）；781型磁力加热搅拌器（上海南汇电讯器材厂）；超声清洗机（Branson200型，中美合资必能信超有限公司，上海）。

1.3 实验方法 单个核细胞的分离：所有病例均在无菌条件下抽取骨髓2 ml注入EDTA抗凝试管中，加入4 mlPBS（pH7.4）缓冲液稀释。采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离单个核细胞。分离好的单个核细胞中加入2 ml PBS液，混匀，制成悬浮液，用细胞计数器计数并求出细胞的密度。

细胞提取液的制备：采用冷冻复融法和超声波溶膜法。将已计数的1 ml在PBS溶液中的细胞悬浮液放到20 ℃冷冻，在37 ℃融化后，置于冰浴中在超声波中溶膜，得到细胞提取液。在实验时，直接将细胞提取液用PBS稀释一定倍数后使用。

细胞提取液中MPO的测定采用毛细管电泳电化学检测法，实验中以PBS为电泳缓冲液。将细胞提取液在5.0 kV进样10 s后，在20 kV的电压下运行60 s。再在毛细管中与底物氢醌（H2Q）和过氧化氢（H2O2）柱上孵育10 min，H2Q和H2O2与MPO发生催化反应，反应方程式示于式［1］。生成的苯醌（BQ）又随着压力向检测端移动，到达检测器时，用碳纤维盘束电极检测。在电极上的反应示于式［2］。

H2Q+H2O2MPOBQ+2H2O（1）

BQ+2H++2e-H2Q（2）

由于过氧化物酶催化底物的反应为专一反应，电化学检测到的是BQ，所以电泳峰便对应于细胞提取液中的MPO活性。细胞提取液中MPO的活性是根据已知的辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP)的标准曲线定量的。不同浓度的标准HRP溶液在相同检测条件下进行毛细管电泳电化学检测，可以得到HRP的标准曲线。由于MPO和HRP都是过氧化物酶，在催化过氧化物的性能以及活性的表征和测量方面是相同的。而酶的活性大小，是用酶的活性单位（u）来度量。即使酶的来源不同，其活性测定方法是相同的，因为它们都是转化相同的过氧化物（底物）。所以可以用标准HRP的活性定量MPO的活性。

根据多次测定细胞提取液的结果计算得到细胞提取液中MPO的平均活性浓度（u/ml），再根据细胞悬浮液中细胞浓度（cell/ml），可以计算出每个细胞中MPO的平均含量（u）。

1.4 统计学处理 用SPSS12.0统计软件将所有检测数据及病例相关资料建立数据库，对照组与ANLL组间的比较采用两样本均数的t检验；ANLL各亚型间的比较采用方差分析F检验，(P

2 结果

MPO在ANLL中的表达结果及其与ANLL各亚型之间的关系见表1、表2和表3。

将M1- M5型MPO平均值进行方差分析结果示：M3病例的MPO平均值最高，与其他4组比较差异有统计学意义（P0.05），但与其他3组比较差异有统计学意义（P

7例M2为M2a 5例，M2b2例；6例M4 为M4a 4例，M4b2例；8例M5为M5a 3例，M5b5例。因各亚型病例数限制，未对其两两之间的比较进行统计学分析，但检测其细胞中MPO值的结果（如表3），符合M2b>M2a、M4a>M4b和M5b>M5a趋势。

3 讨论

MPO又称过氧化物酶 ，是一种重要的含铁溶酶体，存在于髓系细胞（主要是中性粒细胞和单核细胞）的嗜苯胺蓝颗粒中，它与过氧化氢和卤化物构成中性粒细胞有效的杀菌系统，在机体的免疫防御过程中发挥重要作用。同时，MPO的3种亚型（MPOⅠ,Ⅱ,Ⅲ）均是DNA结合蛋白，能与DNA形成牢固的复合物，防止其在氧化过程中受损，从而保证髓系细胞的正常分化成熟及功能［7］。随着对MPO研究的深入，人们发现MPO在发挥其免疫防御作用的同时，它与多种致癌物，尤其是芳胺类致癌物的活化有关［8］，在膀胱癌、肺癌及胃癌等多种肿瘤的发生、发展过程中发挥作用。