β3-肾上腺素能受体及UCP2基因多态性与儿童单纯性肥胖的关系

【摘要】 目的 研究β3-肾上腺素能受体基因的Trp64Arg变异与UCP2基因Ala55Val变异对儿童单纯性肥胖的影响是否存在交互作用，为儿童单纯性肥胖的防治提供理论依据。方法用聚合酶链反应―限制性片段长度多态性方法（PCR-RFLP）检测UCP2基因Ala55Val及β3-AR基因Trp64Arg的多态性，比较病例组与对照组各基因型的发生频率以及不同基因型之间BMI、血液生化指标的差异。结果 β3-AR的变异频率在单纯性肥胖组和对照组差异有统计学意义（P=0.038），UCP2基因的变异频率在2组之间差异也有统计学意义（P=0.045）。当只有单一的UCP2或β3-AR变异基因型时,病例组与对照组的频率分布差异无统计学意义；但当UCP2 和β3-AR基因同时发生变异时,病例组的变异基因频率明显高于正常组(OR=4.002，95%可信区间为1.636～9.884)。结论 UCP2基因Ala55Val变异与β3-AR基因Trp64Arg变异同时发生时，会明显增加儿童单纯性肥胖症发生的危险性。

【关键词】 受体，肾上腺素能β3；多态性，单核苷酸；肥胖症；儿童

【中图分类号】 R 179 R 589.2 Q 754 【文献标识码】 A 【文章编号】 1000-9817(2007)03-0249-04

根据国际肥胖专家工作组(International Obesity Task Force,IOTF) 提供的数据以及世界卫生组织(WHO)的疾病负担报告,目前全球儿童超重率接近10%,肥胖率为2%～3%［1］。儿童肥胖与肥胖易感环境（膳食能量过多、体力活动不足、生活方式由“动”趋“静”、群众营养健康知识缺乏、各种不良社会因素等）有一定关联［2］；但有的儿童运动并不少,饮食并不多,却也发生了肥胖。这种现象不能完全以环境因素来解释,可能与遗传有一定联系［3］。

人类β3-AR的受体基因位于第8号染色体上（8p11-12），包括2个外显子，1个内含子，β3-AR在棕色脂肪组织的生热作用和白色脂肪的脂解作用中起重要的作用［4-5］。UCP2定位于人类11号染色体(11q13)，包含8个外显子，位于线粒体内膜的UCP2具有“质子漏”即驱散H+梯度的功能,能够驱散在线粒体呼吸时形成的H+梯度,使氧化过程与磷酸化过程“解偶联”，ATP生成减少［6］，主要参与脂肪和能量代谢的组织中表达。笔者用PCR-RFLP检测UCP2基因Ala55Val及β3-AR基因Trp64Arg的多态性，从而探讨UCP2基因Ala55Val变异及β3-AR基因Trp64Arg变异与儿童单纯性肥胖的关系。

1 对象与方法

1.1 对象

1.1.1 筛查标准 2～6岁儿童参照WHO儿童肥胖诊断标准，以体重超过同年龄、同性别身高标准体重的10％为超重，超过20％为肥胖。肥胖分度：以超过同年龄、同性别身高标准体重的20%～29％为轻度，30%～49％为中度，≥50％为重度肥胖［7-8］。7～12岁儿童利用身高、体重测量值计算BMI指数后，按照国际生命科学学会中国肥胖工作组（WGOC）2003年11月颁布的“中国儿童青少年超重、肥胖体重指数筛查分类标准”进行判断［9］。

1.1.2 病例组与对照组的选择 排除病理性及药物性肥胖，按上述标准从2 641名2～12岁儿童中筛查出单纯性肥胖173例，从中随机选择100例作为病例组（男55例，女45例），并按照与病例同年龄（±6个月）、同性别、同身高（±3 cm）、体重正常的标准选择100例健康儿童作为对照，以求与肥胖儿童生长发育水平一致。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的检测 采用常规酚/氯仿抽提外周血基因组DNA，用聚合酶链反应―限制性片段长度多态性方法（PCR-RFLP）检测UCP2基因Ala55Val及β3-AR基因Trp64Arg的多态性。（1）β3-AR基因Trp64Arg的多态性检测：引物设计参照相关报道［10］的序列。上游引物：CGCCCAATACCGCCAACAC，下游引物：CCACCAGGAGTCCCATCACC。反应体系：以1 μL DNA为模板在总反应体积20 μL内行PCR扩增，扩增产物为210 bp，用2％琼脂糖凝胶90 V电泳30 min。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，最后72 ℃进一步延伸10 min。在10 μL酶切体系中限制性内切酶BstNI(MvaI)［酶切位点CC(A/T)GG］0.5 μL酶解PCR产物5 μL，在37 ℃水浴过夜。用3％琼脂糖凝胶电泳，120 V，50 min，分离酶解产物片断。Trp/Trp基因型的电泳带型为99 bp，62 bp，30 bp，12 bp，7 bp，Arg/Arg基因型的电泳带型为161 bp，30 bp，12 bp，7 bp，Trp/Arg基因型的电泳带型161 bp，99 bp，62 bp，30 bp，12 bp，7 bp。（2）UCP2基因Ala55Val多态性的检测：引物序列自行设计。上游引物为：CCCCTCAAGGGCCAGTGTTTGGAGCA，下游引物为：CACCGCGGTACTGGGCGCCG。反应体系：以1 μL DNA为模板在总反应体积20 μL内行PCR扩增,扩增产物为150bp，用2％琼脂糖凝胶90 V电泳30 min。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，68 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，最后72 ℃进一步延伸10 min。在10 μL酶切体系中限制性内切酶HPAII（酶切位点CCGG）0.5 μL酶解PCR产物5 μL，在37 ℃水浴过夜。用4％琼脂糖凝胶电泳，110 V，50 min，分离酶解产物片断。Ala/Ala基因型的电泳带型为130 bp，20 bp，Val/Val基因型的电泳带型为150 bp，Ala/Val基因型的电泳带型150 bp，130 bp，20 bp。

1.2.2 一般体检和血液生化指标 由专人对受检者的身高、体重进行测量，计算BMI指数；血液生化指标（三酰甘油、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白）由专人采用全自动生化分析仪检测。

1.2.3 统计分析 研究样本的群体代表性予以Hardy-Weiberg 平衡检验确认。用SPSS 11.0统计软件进行数据分析，多组计量资料用单因素方差分析，计数资料用χ2检验。

2 结果

2.1 β3-AR基因Trp64Arg的变异对正常儿童及单纯性肥胖儿童的影响 由表1可见，β3-AR的变异频率在2组之间差异有统计学意义（P=0.038）。各变异基因型之间只有三酰甘油(P=0.000)和高密度脂蛋白(P=0.003)差异有统计学意义（表2），其他血液指标及BMI差异均无统计学意义。进一步分析发现，携带Arg/Arg基因型的变异者三酰甘油显著高于携带Trp/Trp基因型（P=0.000）及Trp/Arg基因型(P=0.000)，携带Arg/Arg基因型的变异者高密度脂蛋白显著低于携带Trp/Trp基因型变异者(P=0.001)及Trp/Arg基因型变异者(P=0.005)，携带Trp/Trp基因型与携带Trp/Arg基因型变异者之间差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 UCP2基因Ala55Val的变异对正常儿童及单纯性肥胖儿童的影响 表3表明，UCP2基因的变异频率在2组之间差异有统计学意义（P=0.045）。进一步分析发现，Ala/Val基因型的发生频率与Ala/Ala基因型的发生频率差异有统计学意义（P=0.027），Val/Val基因型的发生频率与Ala/Ala基因型及Ala/Val基因型的发生频率差异均无统计学意义。各变异基因组之间只有BMI差异有统计学意义（P=0.031）（表4），与各血液生化指标差异均无统计学意义。进一步分析发现，Ala/Val基因型的BMI显著高于Ala/Ala基因型（P=0.009），Val/Val基因型与Ala/Ala基因型及Ala/Val基因型差异均无统计学意义。

2.3 β3-AR基因Trp64Arg的变异及UCP2基因Ala55Val的变异对儿童单纯性肥胖的交互作用 表5显示，按携带的基因型不同分为4组（β3-AR和UCP2均无变异，仅有UCP2变异，仅有β3-AR变异，β3-AR和UCP2均变异）。当只有单一的UCP2或β3-AR基因变异时,病例组与对照组的频率分布差异无统计学意义；但当UCP2和β3-AR 2基因同时发生变异时,病例组的变异基因频率则明显高于对照组(OR=4.002，95%CI为1.636～9.884)；2基因同时变异与仅有单一的UCP2基因变异而无β3-AR变异相比(OR=2.389，95%CI为1.027～5.556) ，或2基因同时变异与仅有单一的β3-AR基因变异而无UCP2基因变异相比(OR=3.571，95%CI为1.062～12.010)，病例组的频率都明显高于对照组。表6显示，4组之间BMI和高密度脂蛋白差异有统计学意义（P=0.041和P=0.017），其他血液生化指标差异无统计学意义。进一步分析发现，两者都变异者BMI显著高于两者均无变异者（P=0.010）及仅有UCP2变异者（P=0.037），且2基因均变异者高密度脂蛋白显著低于均无变异者（P=0.047）、仅有UCP2变异（P=0.002）及仅有β3-AR变异者（P=0.026）。

3 讨论

β3-AR在棕色脂肪组织的生热和白色脂肪的脂解中起重要的作用。有研究发现，β3-AR的Trp64Arg变异与中心性肥胖密切相关，Trp64Arg杂合子个体却有较低的血清三酰甘油水平，这可能与中心脂肪的脂解作用的降低有关［4-5］。β3-AR基因变异是体重、BMI、腰围、臀围增大的因素［11］，携带Trp64Arg基因者在经过严格饮食控制和运动治疗后与对照组比较减重困难［12］；而Kurokawa等［13］却发现，β3-AR基因Trp64Arg变异与日本中学生脂肪堆积作用的关系并不十分密切。笔者研究发现，Arg/Arg纯合子变异者有较低的高密度脂蛋白及较高的三酰甘油，表明β3-AR的变异可能与儿童单纯性肥胖有关。但由于本研究中纯合子变异个体比较少，仍需要进一步证实。

UCP为线粒体内膜的质子载体，可以将内膜外侧的H+运回内侧，降低了物质氧化过程中H+形成的膜2侧的电化学剃度，使氧化过程与ADP的磷酸化过程脱偶连，ATP生成减少，能量消耗和产热增多，体重下降。George等［14］对Caucasian和美籍黑人UCP2基因编码序列的分析，发现外显子2Ala55Val突变,该氨基酸替换发生在第1和第2跨膜区之间的基质向膜外环处，是常见的UCP2基因变异。有研究发现，UCP2基因的变异在能量代谢中起重要作用，但并不是Pima印第安人Ⅱ型糖尿病及肥胖的发生原因［15］。Walder等［16］研究发现，UCP2的Ala55Val突变与Pima印第安青年人睡眠时代谢率相关。UCP2基因Ala55Val变异与中国女性股部皮下脂肪面积和体重指数相关［17］。笔者研究也发现，UCP2基因Ala55Val变异与单纯性肥胖儿童的体重指数相关的是Ala/Val突变,表明UCP2变异可能对正常儿童有脂肪沉积作用。

另外，在肥胖的日本人［18］减肥抵抗及减肥后难以维持体重方面，UCP1与β3-AR基因有协同作用。Hsueh等［19］在肥胖症病人中亦证实了携带β3-AR和PPARγ2 2基因变异者具有较高的胰岛素、瘦素水平和腰围、BMI；Ochoa等［20］通过对儿童青少年的病例对照研究发现，β3-AR 和PPARγ2基因的变异对增加肥胖的危险性有协同作用。本研究也发现，2基因均变异者具有较高的BMI及较低的高密度脂蛋白；另外当只有单一的UCP2或β3-AR基因变异时,病例组与对照组的基因变异频率分布差异无统计学意义。但当UCP2和β3-AR基因同时发生变异时,病例组的基因变异频率则明显高于正常组(OR=4.002，95%可信区间为1.636～9.884)；2基因同时变异与单一的UCP2基因变异(OR=2.389，95%可信区间为1.027～5.556)或单一的β3-AR 基因变异(OR=3.571，95%可信区间为1.062～12.010)相比，病例组的频率都明显高于对照组，提示UCP2基因Ala55Val与β3-AR基因Trp64Arg同时变异明显增加了儿童单纯性肥胖症发生的危险性。

大量的研究资料提示,人类肥胖通常涉及较为复杂的遗传背景,多种相关蛋白因子不同程度的遗传缺陷可能是人类肥胖的易患原因。

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