时间：2022-06-14 06:37:59
【摘要】
目的 建立测定结核灵片中狼毒乙素含量的方法。方法 采用高效液相色谱法，色谱柱为agilent hc?c18,流动相为甲醇?水（体积比70∶30），流速1.0 ml/min，检测波长291 nm，柱温为室温。结果 狼毒乙素质量浓度在0.606～ 7.278 μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系，r=0.999 8；平均回收率为100.20%，rsd为0.29%（n=6）。结论 本方法简便、准确，可用于测定结核灵片中狼毒乙素的含量。
【关键词】 结核灵片 狼毒乙素 hplc
结核灵片收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第十三册中，由狼毒药材（大戟科植物月腺大戟euphorbia ebracteolata hayata 及狼毒大戟euphorbia fischeriana steud.的根）经煎煮提纯而成，主治淋巴结核，对肺结核及其他淋巴结核亦有疗效［1］。该标准采用紫外分光光度法测定结核灵片中的狼毒乙素含量。本文建立了高效液相色谱法的外标法，结果表明本文方法简便、准确、可靠，可作为该制剂的含量测定方法。
1 仪器与试药
shimadzu岛津lc?2010a高效液相色谱仪，class?vp色谱数据工作站；sartoriusbp211d电子分析天平；jl?180dth超声波清洗器。
结核灵片（江门市恒健药业有限公司提供，批号：070701、071101、080201、080501、080801、081001）。狼毒乙素对照品（由江西万基药物研究院有限责任公司提供，纯度≥99.9%，批号：46113?0601）；甲醇（天津四友，色谱纯）；水为双蒸馏水（自制），其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备
取结核灵片20片，精密称定总质量，求得平均片质量，研细至粉末，取约1 g，精密称定，置50 ml量瓶中，加水5 ml，振摇使成稠膏，加入甲醇35 ml，摇匀，超声20 min，取出，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液,即得。
2.2 阴性样品的制备
用密度为1.32～1.36(60～65 ℃)的淀粉浆代替清膏，按结核灵片的生产工艺及供试品溶液的制备方法制备，即得。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取狼毒乙素对照品0.012 13 g，置100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为狼毒乙素对照品储备液（121.3 μg/ml）。再精密量取2 ml，置100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为狼毒乙素对照品溶液（2.426 μg/ml）。
2.4 色谱条件
色谱柱为agilent hc?c18（4.6 mm×250 mm，5 μm，安捷科技公司）；柱温室温；流动相为甲醇?水（体积比70∶30）；流速为1.0 ml/min；检测波长为291 nm，进样量为20 μl；在该色谱条件下，理论板数按狼毒乙素计算大于2 000，狼毒乙素与杂质峰可达基线分离，分离度大于1.5。色谱图见图1。
2.5 标准曲线的绘制
分别精密吸取上述对照品储备液（121.3 μg/ml）0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 ml，分别置100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度为0.606、1.213、2.426、4.852、7.278 μg/ml的系列溶液。分别精密吸取20 μl进样，按上述色谱条件测定，记录色谱图。以狼毒乙素质量浓度（ρ）为横坐标，狼毒乙素峰面积（a）为纵坐标作图，得回归方程：a=158577ρ-5459.2,r=0.999 8(n=5)。结果表明狼毒乙素质量浓度在0.606～7.278 μg/ml范围内与峰面积线性关系良好。
2.6 重复性试验
取同一批结核灵片(批号070701)，按“2.1”项下制备方法平行制备6份供试品溶液，分别依法进样，测得峰面积并计算含量，结果测得平均含量为0.01439%，rsd为0.34%。
2.7 稳定性试验
取供试品溶液20 μl，分别在0、2、5、7、10、12 h进样，共测5次，结果测得狼毒乙素含量的rsd值为0.31%，表明供试品溶液在12 h内测定稳定。
2.8 回收率试验
取同一批结核灵片(批号070701) 粉末1 g，精密称定，共6份，分别置50 ml量瓶中，精密加入狼毒乙素对照品储备液（121.3 μg/ml）2 ml，按“2.1”项下方法制备溶液，并进样测定，计算平均回收率为100.20%, rsd为0.29%（n=6）。见表1。
a.狼毒乙素对照品; b.供试品; c.阴性对照样品
图1 结核灵片高效液相色谱图（略）
figure 1 hplc chromatograms of zieheling pills
表1 狼毒乙素加样回收率试验结果（略）
table 1 results of recovery test
2.9 含量测定及含量限度
分别精密称定6批结核灵片各3份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，依法进样测定，结果见表2。因狼毒是毒性中药材，有必要确定含量限度，建议每片结核灵片含狼毒乙素为0.028 8 ～0.043 2 mg/片。
表2 样品含量测定结果（略）
table 2 assay results of samples
3 讨论
3.1 狼毒药材的化学成分主要包括黄酮、二萜、香豆素类等［2］，其中狼毒乙素对结核杆菌有明显的抑制作用［3］，因此选择狼毒乙素作为结核灵片含量测定的指标成分。
3.2 曾以甲醇作溶剂，但提取效果不理想；也尝试用流动相作溶剂，提取效果理想，但狼毒乙素受结核灵片中的其他成分干扰，达不到良好的分离效果。
3.3 实验中还考察了不同柱温(10、20、30、40 ℃)对色谱分离效果的影响，结果各柱温对分离效果、保留时间的影响无明显区别，因此确定以柱温为室温。
【参考文献】
［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准：中药成方制剂（第十三册）［m］.北京：化学工业出版社，1997:160.
［2］ 董钰明，李海燕. 中药狼毒化学成分、药理作用及有效成分含量测定的研究概况［j/ol］. 中国科技论文在线，.
［3］ 赵奎君，徐国钧，金蓉鸾，等.hplc法测定月腺大戟根中狼毒甲素及狼毒乙素的含量［j］.中草药，1995，26(2):66-67.