时间:2022-06-14 06:37:59
【摘要】
目的 建立测定结核灵片中狼毒乙素含量的方法。方法 采用高效液相色谱法,色谱柱为agilent hc?c18,流动相为甲醇?水(体积比70∶30),流速1.0 ml/min,检测波长291 nm,柱温为室温。结果 狼毒乙素质量浓度在0.606~ 7.278 μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系,r=0.999 8;平均回收率为100.20%,rsd为0.29%(n=6)。结论 本方法简便、准确,可用于测定结核灵片中狼毒乙素的含量。
【关键词】 结核灵片 狼毒乙素 hplc
结核灵片收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第十三册中,由狼毒药材(大戟科植物月腺大戟euphorbia ebracteolata hayata 及狼毒大戟euphorbia fischeriana steud.的根)经煎煮提纯而成,主治淋巴结核,对肺结核及其他淋巴结核亦有疗效[1]。该标准采用紫外分光光度法测定结核灵片中的狼毒乙素含量。本文建立了高效液相色谱法的外标法,结果表明本文方法简便、准确、可靠,可作为该制剂的含量测定方法。
1 仪器与试药
shimadzu岛津lc?2010a高效液相色谱仪,class?vp色谱数据工作站;sartoriusbp211d电子分析天平;jl?180dth超声波清洗器。
结核灵片(江门市恒健药业有限公司提供,批号:070701、071101、080201、080501、080801、081001)。狼毒乙素对照品(由江西万基药物研究院有限责任公司提供,纯度≥99.9%,批号:46113?0601);甲醇(天津四友,色谱纯);水为双蒸馏水(自制),其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备
取结核灵片20片,精密称定总质量,求得平均片质量,研细至粉末,取约1 g,精密称定,置50 ml量瓶中,加水5 ml,振摇使成稠膏,加入甲醇35 ml,摇匀,超声20 min,取出,放冷,加甲醇至刻度,摇匀,用0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
2.2 阴性样品的制备
用密度为1.32~1.36(60~65 ℃)的淀粉浆代替清膏,按结核灵片的生产工艺及供试品溶液的制备方法制备,即得。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取狼毒乙素对照品0.012 13 g,置100 ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为狼毒乙素对照品储备液(121.3 μg/ml)。再精密量取2 ml,置100 ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为狼毒乙素对照品溶液(2.426 μg/ml)。
2.4 色谱条件
色谱柱为agilent hc?c18(4.6 mm×250 mm,5 μm,安捷科技公司);柱温室温;流动相为甲醇?水(体积比70∶30);流速为1.0 ml/min;检测波长为291 nm,进样量为20 μl;在该色谱条件下,理论板数按狼毒乙素计算大于2 000,狼毒乙素与杂质峰可达基线分离,分离度大于1.5。色谱图见图1。
2.5 标准曲线的绘制
分别精密吸取上述对照品储备液(121.3 μg/ml)0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 ml,分别置100 ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制得质量浓度为0.606、1.213、2.426、4.852、7.278 μg/ml的系列溶液。分别精密吸取20 μl进样,按上述色谱条件测定,记录色谱图。以狼毒乙素质量浓度(ρ)为横坐标,狼毒乙素峰面积(a)为纵坐标作图,得回归方程:a=158577ρ-5459.2,r=0.999 8(n=5)。结果表明狼毒乙素质量浓度在0.606~7.278 μg/ml范围内与峰面积线性关系良好。
2.6 重复性试验
取同一批结核灵片(批号070701),按“2.1”项下制备方法平行制备6份供试品溶液,分别依法进样,测得峰面积并计算含量,结果测得平均含量为0.01439%,rsd为0.34%。
2.7 稳定性试验
取供试品溶液20 μl,分别在0、2、5、7、10、12 h进样,共测5次,结果测得狼毒乙素含量的rsd值为0.31%,表明供试品溶液在12 h内测定稳定。
2.8 回收率试验
取同一批结核灵片(批号070701) 粉末1 g,精密称定,共6份,分别置50 ml量瓶中,精密加入狼毒乙素对照品储备液(121.3 μg/ml)2 ml,按“2.1”项下方法制备溶液,并进样测定,计算平均回收率为100.20%, rsd为0.29%(n=6)。见表1。
a.狼毒乙素对照品; b.供试品; c.阴性对照样品
图1 结核灵片高效液相色谱图(略)
figure 1 hplc chromatograms of zieheling pills
表1 狼毒乙素加样回收率试验结果(略)
table 1 results of recovery test
2.9 含量测定及含量限度
分别精密称定6批结核灵片各3份,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,依法进样测定,结果见表2。因狼毒是毒性中药材,有必要确定含量限度,建议每片结核灵片含狼毒乙素为0.028 8 ~0.043 2 mg/片。
表2 样品含量测定结果(略)
table 2 assay results of samples
3 讨论
3.1 狼毒药材的化学成分主要包括黄酮、二萜、香豆素类等[2],其中狼毒乙素对结核杆菌有明显的抑制作用[3],因此选择狼毒乙素作为结核灵片含量测定的指标成分。
3.2 曾以甲醇作溶剂,但提取效果不理想;也尝试用流动相作溶剂,提取效果理想,但狼毒乙素受结核灵片中的其他成分干扰,达不到良好的分离效果。
3.3 实验中还考察了不同柱温(10、20、30、40 ℃)对色谱分离效果的影响,结果各柱温对分离效果、保留时间的影响无明显区别,因此确定以柱温为室温。
【参考文献】
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准:中药成方制剂(第十三册)[m].北京:化学工业出版社,1997:160.
[2] 董钰明,李海燕. 中药狼毒化学成分、药理作用及有效成分含量测定的研究概况[j/ol]. 中国科技论文在线,.
[3] 赵奎君,徐国钧,金蓉鸾,等.hplc法测定月腺大戟根中狼毒甲素及狼毒乙素的含量[j].中草药,1995,26(2):66-67.