布氏杆菌病现代检测技术研究进展

摘 要：布氏杆菌病是由布氏杆菌引起以感染家畜为主的共患传染病，对养殖业发展和人民身体健康危害十分严重，在全球造成巨大经济损失，被国家列为二类重大动物疫病。更为重要的是布氏杆菌临床症状不明显，潜伏期长。因此，寻求布氏杆菌病快速高效准确的检测方法尤为重要。本文就布氏杆菌病的现代检测技术研究进展做一综述。

关键词：布氏杆菌；检测技术

中图分类号：S4 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20160932004

布氏杆菌病亦称马耳他热或波状热病，是由布氏杆菌属引起的以家畜为主的多种动物互为传染源的人畜共患病。由于传染性极强，且感染后根治困难，因此造成巨大经济损失。全世界每年因该病造成的经济损失约30亿美元。在中国受布氏杆菌病威胁的人口约有35亿。因此，世界动物卫生组织（OIE）将其列为B类动物疫病，中国将其列为二类动物疫病。

鉴于布氏杆菌病引起的巨大危害，在布病感染早期做出快速诊断对于缓解由此造成的损失尤为重要。目前，临床布氏杆菌检测主要是细菌学检测，费时费力， 不能做到早期快速诊断。随着免疫学的发展，基于免疫技术建立起来的酶联免疫吸附技术的出现大大提高了布氏杆菌病检测的准确性和检测速度。随着分子生物学的发展，特别是微生物基因组测定技术、生物信息学分析技术的发展，以PCR和基因检测技术为主的布氏杆菌病检测技术，以其简单快速、稳定高效、易于自动化操作等特点，成为流行病检测的研究热点。

1 酶联免疫吸附试验

主要包括酶联免疫吸附试验和竞争酶联免疫吸附试验。自1976 年Carlsson首次使用间接ELISA法检测人布氏杆菌病后，已经建立了牛、羊和猪等多种动物的间接ELISA检测布氏杆菌病的方法。目前，已经有商用间接ELISA问世。但是间接ELISA不能区分抗体是疫苗免疫产生还是病株感染引起。因此，不能作为免疫家畜的检测方法。竞争酶联免疫吸附试验能区分疫苗免疫产生的抗体和病株感染引起抗体，且灵敏度高。但目前尚无公认的诊断标准。胶体金免疫层析技术是近年发展起来的新型标记技术，操作更为简便，更适合于布氏杆菌病的诊断。特别是近年来荧光探针分析技术[1-3]在免疫技术中的应用，进一步提高了通过免疫试验检测布氏杆菌病的灵敏度和准确度且成为研究的热点。

2 PCR法

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction ， PCR）是体外扩增DNA序列的技术，是分子生物学的关键技术，它的出现极大地推动了分子生物学的快速发展，并应用到生命科学的不同领域。随着PCR技术及仪器的发展，PCR的扩增效率增加，自动化程度提高，并且发明了多种PCR技术。PCR技术被引进到包括微生物的检测和鉴定在内的多种领域。和传统的微生物的检测和鉴定技术相比，PCR技术具有快速、高效、准确，不破坏样本等优势，成为研究者研究的热点。

利用PCR方法检测病原体，目的基因的选择非常关键。1978 年PCR技术首次用于布氏杆菌检测，是针对布氏杆菌上高度保守的单个基因如BCSP31 和16SrRNA 基因设计的。检测特异性和灵敏度较低。随后，不同的基因被选择进行扩增检测。1990 年Fekete首次报道了成功的利用PCR扩增编码43-KDS19 牛布氏杆菌外膜蛋白的序列的方法快速检测布氏杆菌。1992 年Baily 采用低聚核甙酸引物扩增BCSP31 的基因223bp片段，对牛和羊布氏杆菌有较高特异性。1999年，金红等[4]建立了IS6501 锚定PCR 法， 不仅可以鉴定布氏杆菌并区分不同毒株和生物型， 还可以可鉴别野毒株与疫苗株。2002 年E.Navarro等[5]报道了用PCR 法通过扩增了人布氏杆菌编码牛布氏杆菌抗原31kDa 、16SrRNA和外膜蛋白的基因对人布氏杆菌进行检测。2003 年王胜昌等[6]根据布氏杆菌蛋BSCP31基因设计引物进行布氏杆菌的检测，最低可检测到1pg的布氏杆菌DNA，且特异性非常好。

2013年，王素华等[7]根据GenBank上公布的牛布氏杆菌外膜蛋白OMP31的基因序列设计特异性引物，扩增特异性好的602bp基因片段，建立的检测牛皮布氏杆菌PCR检测方法，敏感性高，最低能够检测到0.9pg/μL的布氏杆菌DNA，并显示出良好的特异性。2014年，Kang等[8]根据布氏杆菌基因组上的BCAN 0548-0549区域基因序列设计特异性引物，扩增约300-bp的片段，首次用于狗的布氏杆菌的专一性检测，检测限为3pg/μL。

3 基因检测技术

随着分子生物学的发展，对微生物基因组进行检测，测定微生物基因的GC含量、Tm值，以及利用核酸杂交技术可以快速的鉴定微生物菌株，并可以轻而易举的精确分辨微生物的类型，讲微生物鉴定到种，亚种或不同的菌株型。因此，基因检测技术如果引物病原微生物的检测，具有准确高效的优势。郭秀兰[9]等将基因检测技术应用到了布氏杆菌的检测。用细菌DNA（ 脱氧核糖核酸） 分子热变性法和DNA 液相分子杂交法测定了布氏杆菌，使得应用细菌DNA 基因测定技术是区别布氏杆菌与非布氏杆菌最可靠的方法之一。

4 展望

由于布氏杆菌病是一种人畜共患疾病，流行趋势日趋严重，容易传染，并且会带来巨大的经济损失，甚至造成人员的死亡，给畜牧业生产和公共卫生安全带来极大的挑战。因此在早期检测布氏杆菌对于缓解由布氏杆菌病带来的危害尤为重要。但是，尽管目前可以在早期进行布氏杆菌病的检测，但这不是应对布氏杆菌病的最佳方式。对待布氏杆菌病，应该从以下几方面开展研究。

4.1 应以预防为主、治疗为辅，积极全面地对抗布病

开展布氏杆菌病防治知识宣传教育，提高人们对布氏杆菌病的认识。

4.2 积极开展布氏杆菌病疫苗的研制，特别是基因工程疫苗的研制

获得稳定安全的布氏杆菌病疫苗，是布氏杆菌病的防治的关键步骤。

4.3 进一步开发快速高效、原位布氏杆菌病检测技术

对于布氏杆菌病的调查和治疗有重要意义。

参考文献

[1] McGiven J A，Tucker J D， Perrett L L.Validation of FPA and cELISA for the detection of antibodies to Brucella abortus in cattlesera and comparison to SAT，CFT，and iELISA[J].Journal of Immunological ethods，2003（278）：171-178.

[2] Burriel A R，Christodoulopoulos G，Bisias G.，et al. Comparison of fluorescence polarization assay， indirect ELISA and competitive ELISA methods for diagnosis of Brucella melitensis-infection in small ruminants[J].Small Ruminant Research，2004（54）：243-247.

[3]Nielsen K，Gall D. Fluorescence polarization assay for the diagnosis of brucellosis[J].a review Immunoassay，2001（22）：183-201.

[4]金红，于康震.布氏杆菌分子生物学研究进展[J].预防兽医学进展，1999（1）：1-4.

[5] Navarro E，Escribano J，Fernández J A，et al. Comparison of three different PCR methods for detection of Brucella， spp.in human blood samples[J].Fems Immunology & Medical Microbiology，2002，34（2）：147-151.

[6]王胜昌，邵讳娟，谢建云，等.布氏杆菌 PCR 检测方法的建立[J].上海实验动物科学，2003，23（3）：154-157.

[7]王素华，王忠才，杜爱芳.牛布氏杆菌PCR检测方法的建立[J].中国畜牧兽医，2012（4）：79-82.

[8] Kang S I，Lee S E，Kim J Y，et al. A new Brucella canis， species-specific PCR assay for the diagnosis of canine brucellosis[J].Comparative Immunology Microbiology & Infectious Diseases，2014，37（4）：237-241.

[9]郭秀兰，天从推，张秀椽，等.基因检测技术在布氏杆菌鉴定中的应用[J].中国畜禽传染病，1989，48（6）：29-31.

作者简介：陈梦（1982-），女，江海，连云港市产品质量监督检验中心，工程师，工程硕士，研究方向：食品质量安全与控制。