康氏木霉固体发酵产孢子粉工艺研究

摘要 通过单因素发酵试验和正交试验，以麸皮、米糠、稻草粉、蔗渣等农副产品为固体培养基，进行了木霉固体发酵工艺优化。结果表明：最佳条件组合为麸皮50 g，葡萄糖1.0%，硫酸铵0.5%，磷酸二氢钾0.05%，发酵温度28 ℃，初始pH值7.0，料水比1∶1.2，发酵周期7 d，经80 cm×40 cm×5 cm不锈钢浅盘固体发酵扩大培养，孢子数产量可达9.6×109 cfu/g，为康氏木霉菌生防制剂生产应用提供了参考。

关键词 康氏木霉；固体发酵；孢子

中图分类号 Q939.9 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）08-0194-03

木霉菌是目前使用最广泛的生防有益菌[1]，对多种土传病原菌具有抑制作用，对白绢病、立枯病、瓜果霉病、疫病等有很好的防治效果[2]。它具有广谱的生防效果和广泛适应性，还可以作为有机菌肥增加作物产量。木霉的生防机制主要包括竞争、重寄生、促进植物发芽、生长、开花的作用等[3]。目前提倡以农业可持续发展为宗旨的植物病虫害生物防治，木霉对人畜无毒害、不污染环境，在绿色农业生产中起着越来越重要的作用[4]。目前生产的木霉菌剂多为分生孢子制剂，与液体发酵相比固态发酵产生的孢子具有较高的质量，孢子对干燥和紫外照射的抵抗性更强，孢子的存活率更高、贮存期加长，并且发酵产品干燥后无须提纯分生孢子可直接制备成菌剂。固体发酵操作简单、材料来源丰富，大量农作物废弃物可作为优良的固体培养基，具有生产成本低廉，孢子产量高、易于保存及运输等优点[5]。该研究通过单因素的正交试验，确定固体发酵工艺条件，为木霉制剂作为生防产品的大规模工业生产提供理论依据和技术参数。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌。康氏木霉，由湖南农业大学生命科学院生物工程实验室提供。

1.1.2 主要仪器。立式高压蒸汽灭菌锅、控温培养箱、光学显微镜、打孔不锈钢浅盘等。

1.1.3 培养基。大试管固体培养基：麸皮（过60目筛）5.0 g，琼脂2.0 g，自来水100 mL，121 ℃灭菌25 min。

1.1.4 康氏木霉孢子液的制备。利用大试管琼脂斜面培养木霉菌，待菌丝长满试管斜面并变为绿色后，向每个试管中加入50 mL无菌水，用玻璃棒搅拌使孢子悬浮在水中，用移液管吸出悬浮液移入灭菌三角瓶中，然后用灭菌水将孢子浓度调整为1×106 cfu/mL备用。

1.2 试验设计

1.2.1 500 mL塑料瓶固体发酵试验。先以麸皮、米糠、稻草粉、玉米秸秆粉、锯木屑、蔗渣（均过80目筛）作为固态发酵的初始培养基，筛选出最佳初始固体培养基。再以其为原料，按原料∶水=1∶1.2的比例混匀，并向500 mL的塑料瓶中加入50 g混匀的固体培养基作为基础培养基，加入不同种类和浓度的碳源、氮源、无机盐；并在不同单因素条件[6]（温度、pH值、料水比、装料量、接种量）下，每个水平3个重复，用纱布和牛皮纸包好，121 ℃灭菌30 min，冷却后接种，置于28 ℃恒温培养箱培养7 d后取样检测孢子数量，根据孢子数量高低确定最佳培养基和发酵条件。

1.2.2 80 cm×40 cm×5 cm不锈钢浅盘固体发酵试验。在500 mL塑料瓶固体发酵正交试验基础上，用80 cm×40 cm×5 cm打孔不锈钢浅盘进行发酵放大培养。

1.3 生物量的测定

孢子计数方法：称取10 g固体培养物，用无菌水定量稀释，充分振荡混匀后，用血球计数板计数。

1.4 数据处理

采用Microsoft—Excel、SAS软件进行数据处理和方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素固体发酵优化试验

2.1.1 初始固体培养基产孢量的影响。向500 mL塑料瓶加入50 g不同固体基础培养基，用纱布和牛皮纸包好，121 ℃灭菌30 min，灭菌冷却后接入1×106 cfu/mL的孢子液3 mL，然后置于28 ℃恒温培养箱培养7 d后取样检测孢子数量。从图1可以看出，以麸皮为固体基础培养基孢子产量最高，达到2.5×109 cfu/g，其次是米糠和锯木屑，分别是1.8×109 cfu/g和1.5×109 cfu/g，所以选择麸皮作为固体基础培养基。

2.1.2 外加碳源对菌产孢量的影响。从图2可以看出，添加葡萄糖芽孢数达4.8×109 cfu/g，与其他碳源差异显著，说明葡萄糖作为快速利用碳源有利于康氏木霉迅速繁殖，也有利于产生孢子[7]。

2.1.3 外加氮源对产孢量的影响。从图3可以看出，菌株孢子数以无机氮源硫酸铵最占优势，有机氮源蛋白胨次之，分别达10.9×109、9.8×109 cfu/g。说明该菌既能利用有机氮源又能利用无机氮源，硫酸铵廉价，所以选择硫酸铵作为最佳外加氮源。

2.1.4 无机盐对菌株产孢量的影响。从图4可以看出，磷酸二氢钾对孢子生长影响最大，与其他无机盐差异明显，其次是氯化铁，平均产孢量达6.5×109、5.5×109cfu/g。其他无机盐对芽孢产量无显著影响，磷酸二氢钾提供磷、钾2种元素，因此确定磷酸二氢钾为最佳无机盐。

2.1.5 温度对菌株产孢量的影响。从图5可以看出，菌体在20～32 ℃时生长较好，28 ℃时孢子形成率最高，24 ℃次之，分别达4.9×109、4.1×109 cfu/g。温度过高会加快水分散失，对数期菌株生长快放出大量热[8]，使固体培养基内部温度迅速上升，不利于菌株生长和孢子形成；温度过低菌株生长缓慢，延长了生产周期。因此，28 ℃是孢子形成最适温度。

2.1.6 初始pH值对菌株产孢量的影响。从图6可以看出，初始pH值为6时产孢量最高，pH值为7时次之，分别达8.2×109、7.9×109 cfu/g。酸性和过碱条件均不利于菌体生长和芽孢形成，在中性偏酸条件下孢子易于形成，考虑工序繁琐和成本问题，选择采用pH值7左右的自来水。

2.1.7 料水比对菌株产孢量的影响。从图7可以看出，料水比为1∶1.2时产孢量最高，达到4.3×109 cfu/g，料水比过低原料过干，会导致灭菌不彻底，并且不利于木霉生长；料水比过高湿度会很大，易结块，不利于透气[9]，所以料水比1∶1.2比较合适。

2.1.8 装料量对菌株产孢量的影响。从图8可以看出，装料量为50 g时孢子量最高，为5.0×109 cfu/g，装料量的多少直接影响通气量和散热，过多散热不快，通气量不足，且固体成块，菌株不能完在上面生长；过少则工作量大，产率低成本增加[10]；所以50 g为最佳装料量。

2.2 多因素正交试验结果

在基础培养基为麸皮∶水=1∶1.2的混合物50g，磷酸二氢钾0.05%，硫酸铵0.5%，自然pH值条件下，采用L9（34）正交设计方案，选择培养温度、pH值、基础培养基种类、料水比4个主要影响因素，进行4因素3水平试验。正交试验因素水平及结果见表1。试验结果表明：不同因素组合，培养基中的孢子数量不同，经9种正交试验组合的筛选，4种因素对其生长量的影响顺序是温度>基础培养基种类>料水比>pH值，说明发酵温度对芽孢形成的影响最大，优组合为A2B1C2D2，即温度28 ℃、基础培养基为麸皮、料水比1∶1.2、pH值7.0。经验证，在基础培养基50 g，葡萄糖1.0%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸铵0.5%，自然pH值，发酵温度28 ℃，发酵周期7 d条件下，康氏木霉孢子数量达9.6×109 cfu/g。

2.3 80 cm×40 cm×5 cm不锈钢浅盘固体发酵扩大培养

在塑料瓶发酵的基础上，用80 cm×40 cm×5 cm不锈钢浅盘固体发酵扩大培养，从发酵第1天开始，每隔1 d进行取样，康氏木霉孢子数如图9所示。可以看出，1～2 d菌体产孢子较少，3～7 d孢子大量产生，7～12 d孢子数没有明显变化，在第7天孢子数量就达到了比较稳定的值，即9.6×109 cfu/g，由此说明，浅盘扩大培养发酵周期与塑料瓶发酵周期基本一致[9]。

3 结论与讨论

研究结果表明：康氏木霉产芽孢最佳培养基配方为：麸皮50 g、葡萄糖1.0%，硫酸铵0.5%，磷酸二氢钾0.05%，温度28 ℃、pH值7.0、料水比1∶1.2、发酵周期7 d，芽孢产量为9.6×109 cfu/g。此发酵培养基配方简单，廉价易得，操作方便，发酵周期短，孢子产量高，可用于工业规模化生产。在浅盘固体发酵时要及时对培养基进行翻动，以利于散热和透气；为了延长木霉孢子的保存期，将发酵好的培养物在自然光照下干燥处理后粉碎，并按一定的比例与滑石粉混合后保存。

4 参考文献

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