岩柏草总黄酮对大鼠肝损伤保护作用的研究

摘要：目的：探讨卷柏对实验性肝损伤大鼠保护作用机理。方法：采用四氯化碳(CCl4)腹腔注射导致大鼠急性肝损伤的动物模型,用岩柏草总黄酮混悬液灌胃给药,并以水飞蓟宾葡甲胺组为实验对照。结果：岩柏草总黄酮能显著地降低CCl4所致大鼠血清中ALT、AST、NO、PGE2和肝组织中MDA的含量；并可使CCl4所致大鼠肝组织中降低的SOD活性升高，改善肝脏组织的病理损伤。结论：岩柏草对CCl4所致大鼠肝损伤具有保护作用，其作用机理可能与降酶、抗脂质过氧化反应、清除自由基、抑制NO过量成生，降低PGE2含量等有关。

关键词：肝损伤；四氯化碳；岩柏草；黄酮

中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-7717(2012)03-0642-02

Protective Effect of Total Flavonoids of Selaginella moellendorfii

Hieron on Experimental Liver Injury in Mice

WANG Fugen,ZHUANG Rangxiao,FANG Hongying,ZHANG Yiqi,XI Jianjun

(The Sixth Hospital Affiliated to Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou 310014,Zhejiang,China)

Abstract:Objective：To explore the protective effect of selaginella moellendorfii hieron on experimental liver injury in mice.Method:Acute liver injury models were made by carbon tetrachloride (CCl4), and then were intragastric administered with selaginella moellendorfii hieron.Result:The change of the serum contents of ALT, AST, NO, PGE2, hepatic tissue SOD, MDA, and pathological tissue slices of liver were observed.The result showed that total flavonoids of selaginella moellendorfii hieron could significantly decrease the serum ALT, AST, NO, PGE2 of abnormally high levels induced by CCl4, decrease MDA and increase the activity of SOD of liver tissue, and ameliorate the pathological injure of liver. Conclusion:The protective mechanisms of total flavonoids on liver injury may be correlated to reducing the serum levels of ALT and AST, inhibiting lipid peroxide, cleaning free radical, restraining the excess production of NO and lowering PGE2.

Key words:liver injury; carbon tetrachloride; selaginella moellendorfii hieron; flavonoids

收稿日期：2011-10-09

作者简介：王福根（1974-），男，浙江绍兴人，副主任药师，硕士，研究方向：肝病药物的研发。岩柏草，学名江南卷柏，又名石柏、地柏枝、黄疸卷柏，为卷柏科卷柏属植物江南卷柏Selaginella moellendorfii Hieron的干燥全草，具有凉血止血，清热利湿的功效[1]，民间用来治疗肝炎、各种内外出血等疾病。文献报导其化学成分以双黄酮类为主，主要含穗花杉双黄酮[2]。前期的研究显示，通过大孔树脂纯化岩柏草总黄酮为0.89%。其作为我院医院制剂复方茵柏合剂的主药之一，使用多年，疗效确切。为了进一步探讨复方茵柏合剂对肝细胞损伤的保护作用，本实验进行了岩柏草总黄酮对四氯化碳引起大鼠急性肝损伤保护作用的研究。

1实验材料

1.1试剂和仪器

岩柏草总黄酮(自制，每0.89g总黄酮相当于岩柏草100g)、水飞蓟宾葡甲胺由西安环宇生物有限公司提供(GY100902)、CCl4由上海凌峰化学试剂有限公司提供(AR，091120)；橄榄油由国药集团化学试剂有限公司提供(AR，F20100512)，AST、ALT、SOD、MDA、NO、PGE2和总蛋白定量测试药盒，均购自南京建成生物工程研究所。

Leica2235轮转式切片机(德国)；日立7060全自动生化分析仪(日本)；Biofuge 28RS低温高速离心机(Heraeus公司，德国)；OlympasB41显微镜(日本)；BT25S型分析天平(德国sartorius)。

1.2实验动物

Wister大鼠，体重(150±10)g，雌雄各半，由浙江省医学科学院实验动物中心提供，动物许可证号SCXK(浙)-20080033。

2实验方法

2.1试剂配制

岩柏草总黄酮用2%CMC-Na100mL溶解成混悬液；CCl4用橄榄油按体积比配制成25%，超声溶解；其它测试试剂按相关的药盒说明书进行配制。

2.2动物实验

取大鼠60只，随机分成6组，每组10只。分别为正常对照组、模型组、高剂量组(40mg/kg)、中剂量组(20mg/kg)、低剂量组(10mg/kg)、阳性对照组(水飞蓟宾葡甲胺组20mg/kg)。给药组每天灌胃1次，剂量为10mL/kg，正常对照组和模型组给予等容积生理盐水，各组大鼠实验期间均予饮用水及全价营养颗粒饲料喂养。大鼠连续给药7天，第7天给药1h后，除正常对照组外，其余均腹腔注射25%CCl4 1mL/kg，禁食18h，用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，下腔门静脉取血，分离血清，检测各指标。肝组织分两部分，一部分置于4%多聚甲醛溶液中，用于病理切片检查；另一部分置于冷冻离心管中在液氮中预冻后转置-80℃冰箱中，待用。

2.3指标检测

2.3.1血清学指标测定取大鼠血液10mL，置于生化采血管中，静止30min，2000×g离心10min，取血清于全自动生化仪检测ALT、AST，用ELSIA检测NO和PGE2。

2.3.2肝组织ELSIA检测精密称取取大鼠肝脏100mg，置于玻璃瓶中，加生理盐水1mL，用高速匀浆机制成10%匀浆液，于4℃ 2000×g离心10min，分离上清液用于SOD和MDA ELSIA检测，并按相关的试剂盒操作说明书进行。

2.3.3肝组织病理学检查在光镜下观察肝组织切片的病理形态学变化，肝组织病理学改变分为5级：正常肝细胞“-”、肝细胞点状坏死“+”、肝细胞灶状坏死“++”、肝小叶不足1/3肝细胞坏死“+++”、肝小叶超过1/3肝细胞坏死“++++”。

2.4数据统计处理

采用SPSS软件进行分析，数据结果用均值±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验。

[WT5”FZ〗中华中医药学刊3实验结果

3.1血清各指标

模型组大鼠ALT、AST、MDA、NO和PGE2均显著高于正常组， SOD显著低于正常组；岩柏草总黄酮高中治疗组ALT、AST、MDA、NO和PGE2均低于模型组，SOD高于模型组，具有显著性差异，P＜0.05。各实验组血清和肝组织指标检测结果见表1和表2。

表1各组大鼠血清指标ALT、AST、SOD比较(±s)

组别nALT(U/L)AST(U/L)NO(μmol/L)PEG2(pg/mL)正常组1059.0±4.331.6±7.235.6±1.950.3±3.2CCl4模型组9178.3±21.0*100.7±14.6*68.7±5.7*100.2±7.2*低剂量治疗组9155.0±18.190.3±9.260.4±3.880.2±5.6Δ中剂量治疗组10100.5±5.7Δ88.5±7.745.0±3.1Δ72.6±4.1Δ高剂量治疗组877.7±6.7Δ47.3.6±5.9Δ39.7±2.3Δ61.1±3.9Δ对照组1084.0±5.7Δ53.7±6.941.5±3.2Δ56.8±4.0Δ注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较ΔP＜0.05。

表2各组大鼠肝组织SOD、MDA、NO、PEG2比较(±s)

组别nSOD

(NU/mgPr)MDA

(mmol/mgPr)正常组10381.8±24.638.0±2.5CCl4模型组9201.4±27.0*80.1±5.9*低剂量治疗组9228.1±22.675.5±3.9中剂量治疗组10307.8±25.3Δ69.2±4.6高剂量治疗组8355.6±20.4Δ45.7±1.2Δ对照组10366.1±30.1Δ42.4±2.7Δ注：与正常组比较*P＜0.05；与模型组比较ΔP＜0.05。

3.2病理检查

正常组大鼠肉眼观察肝脏形态正常，被膜光滑，肝小叶结构正常，肝细胞索、汇管区、胆管上皮细胞等形态结构清晰，未见变性、坏死等病理改变。模型组造模后第1~3天肝脏均可见以腺泡Ⅲ带肝细胞为主的不同程度的病理改变，肉眼可见肝脏体积增大，边缘变钝，色黯，质脆，脂肪变性及炎细胞浸润，汇管区缩小，病理评级在“++”~“+++”之间。岩柏草总黄酮治疗组肝细胞索排列较整齐，少数肝细胞轻度水肿，未见明显脂肪变性及坏死，病理评级在“-”~“+”之间，治疗量岩柏草总黄酮可减轻 CCl4致大鼠肝脏病理损伤。水飞蓟宾葡甲胺治疗组肝脏损伤肉眼观察色泽正常，质软，镜下可见中央静脉周围肝细胞脂肪变性，点状坏死，少量炎症细胞浸润，汇管区未见明显异常[3]。

4讨论

CCl4是实验性肝损伤动物模型常用造模剂，CCl4进入机体后，经肝脏细胞色素P450激活，生成三氯甲基自由基，使内质网膜上脂质氧化反应，引起膜结构和功能完整性的破坏，造成肝组织的病理学损伤[4]。同时，肝脏由于CCl4攻击而受到损伤使得转氨酶、炎症介质NO、PGE2异常增高及脂质过氧化的主要产物MDA含量增高、SOD活性降低。

NO又称血管内皮因子，是一种新的免疫分子和炎症介质，在免疫调节和炎症中发挥作用，参与了机体多种生理及病理过程，影响着多种疾病的发展。NO作为一个炎性介质，其具有双重作用，一方面NO是一种强力的血管扩张剂，可引起血管漏出；另一方面NO能抑制PGE2、血栓素、白细胞介素-6的合成，显示抗炎作用。但是，过量的NO本身可作为自由基或通过与自由基反应生成毒性更强的自由基或以尚未明了的方式造成肝损伤。已有大量的证据表明NO在多种原因引起的肝损伤中起重要作用。在中医理论中肝脏是血液循环系统的重要成员,主要表现在“肝藏血”，而NO有助于通过循环系统对肝脏起保护作用。前列腺素是炎症反应的重要介质，炎症的发生发展与前列腺素含量关系密切，而在炎症过程中，PGE2作用最强，是重要的炎症反应介质。本实验结果表明，卷柏既可以抑制肝损伤时NO过量产生，降低大鼠异常增高的NO、PGE2水平。这可能是通过抑制NO的细胞毒效应发挥作用的，提示抑制NO的过量产生是其保肝作用的一个环节[5]。

本次实验研究结果表明卷柏可显著降低血清中ALT、AST，增加机体SOD活力，抑制脂质过氧化反应及其产物MDA的产生，增强机体抗氧化能力，加速自由基的清除；通过抑制NO、PGE2的过量分泌，使血清中异常增高的NO、PGE2含量降低，减轻其介导的炎性反应，从而达到修复肝细胞损伤的作用，保护肝脏的结构和功能。这些可能就是岩柏草对CCl4所致肝组织损伤具有保护作用的药理作用机制。此次实验研究补充了岩柏草在保护肝组织损伤方面的药理作用，为临床应用提供实验理论依据。但由于岩柏草含有复杂的化学成分，有必要对保肝作用的有效成分、有效部位做进一步研究[6]。

参考文献

［1］万定荣,陈科力,詹亚华.湖北省卷柏科药用植物调查与研究[J].中国中药杂志,2005,30 (19):1507-1510.

[2]戴忠,王力钢,林瑞超,等.卷柏属植物黄酮类成研究进展[J].中国药品标准, 2000, 1 (4): 46-49.

[3]洪照友,高毅,詹兴海.中药虎杖对大鼠肝脏缺血性损伤保护的形态学观察[J].世界华人消化杂志,2000,8(2):162-164.

[4]Hiroaki Nakajima,Hitoshi Takagi,Norio Horiguchi,et al.Lackof macrophage inhibitor factor protects mice against concanavalinA-induced liver injury[J].Liver International,2006,26(3):346-351.

[5]黄华,陈会华,杨晋辉.实验性急性肝损伤血清IL-18、NO的检测意义及作用机制研究[J].胃肠病学和肝病学杂志,2003,12(4):343-345.

[6]江雪平,陈科力.江南卷柏中双黄酮类化合物的研究[J].中国药学杂志,2009,44(2):96-98.