脂多糖对脐血CD34+细胞体外增殖的影响

作者：张宇明，江黎明，熊 丹，李庆华，杨志刚

【摘要】 目的：研究脂多糖(lps)对脐血干/祖细胞体外增殖的影响，探寻脐血干/祖细胞体外扩增的新方法。方法：将不同浓度的自制脂多糖和标准脂多糖分别加入含有脐血cd34+细胞的液体培养体系中培养，采用mtt测定方法分别测定脐血cd34+细胞增殖率。结果：不同浓度的自制脂多糖与标准脂多糖均可出现低浓度促进脐血cd34+细胞增殖，高浓度抑制其增殖的作用。最佳效应浓度分别在30 u/ml及10 mg/l。结论：脂多糖对脐血cd34+细胞体外增殖可能具有调节作用。

【关键词】 胎血;干细胞;细胞增殖;脂多糖类

[abstract] objective: to study the effect of lipopolysaccharide (lps) on cord blood hematopoietic stem/progenitor cells proliferation in vitro, and explore the new way of proliferation in vitro. methods: selfmade?lipopolysaccharide and standard?lipopolysaccharideat different concentrations were added into cord blood cd34+ cells liquid culture system respectively, the cord blood hematopoietic stem/progenitor cells was analyzed by mtt.results: selfmade?lipopolysaccharide and standard?lipopolysaccharide at different concentrations could promote proliferation of cord blood cd34+ cells in lps at low concentration, and were inhibited in high concentrations lps. the best concentration were 30u/ml and 10mg /l respectively. conclusion: lipopolysaccharide may play a role in regulating the cord blood hematopoietic stem/progenitor cells proliferation in vitro.

[key words] cord blood; stem cell; cell proliferation; lipopolysaccharide

体外扩增是克服脐血cd34+细胞数量不足的最直接的方法，也是最有应用前景的方法之一[1]。如能有效地将脐血cd34+细胞进行体外扩增, 不仅可以拓宽脐血移植在临床的使用范围，而且还有利于推动大剂量化疗的发展及以脐血cd34+细胞为靶细胞的基因治疗的开展。本研究的目的就是要通过分析比较不同脂多糖对脐血cd34+细胞在体外增殖的影响，以探寻脐血cd34+细胞体外扩增的新方案。

1 材料与方法

1.1 标本来源

10例正常脐血标本取自广东医学院附属医院妇产科及湛江市妇幼保健院妇产科, 肝素抗凝。

1.2 仪器设备与药品试剂

1.2.1 主要仪器设备 二氧化碳培养箱(sanyo mco?15a日本)、医用净化工作台(j?875da苏州净化设备公司)、台式低速离心机(ld5?2a北京医用离心机厂)、倒置相差显微镜(olympus imt?i日本)、epicsxl 型流式细胞分析技术(cowter co. u.s.a)。

1.2.2 主要药品试剂 rpmi 1640(gibco 公司)、淋巴细胞分离液(1.077 g/ml,上海试剂二厂)、新生小牛血清(杭州四季青)、四甲基偶氮唑(mtt)(sigma, u.s.a)、标准脂多糖(sigma , u.s.a) 、自制脂多糖(由本院李延平教授自制)。

1.3 方法和步骤

1.3.1 脐血cd34+细胞的分选 (1)脐血单个核细胞的分离：加入2倍rpmi1640培养液稀释脐血，室温轻摇10 min充分混匀，按1∶1的比例将稀释后的脐血液沿管壁缓慢加入装有淋巴细胞分离液的离心管上层，小心不要混匀;小心收集界面层的单个核细胞，加入pbs中，20 ℃ 1 200 r/min离心15 min洗涤2次;沉淀细胞团加入3 ml rpmi 1640培养基，充分混匀后计数细胞数和台盼蓝拒染细胞活力检查;在3 min内，用血球计数板分别计数活细胞和死细胞。镜下活细胞拒染，死细胞被染成蓝色。

(2)脐血单个核细胞的cd34+细胞的分选：应用德国美天旎生物技术公司的磁分选器和单克隆抗体免疫磁珠(阳性)分选法进行提取。

1.3.2 观察脂多糖对脐血cd34+细胞体外增殖的影响 (1)脐血cd34+细胞接种: 配制含脐血cd34+细胞的溶液, 参照文献[2]液体培养体系为rpmi 1640含终浓度为20%fbs, bsa(10g/l), gm?csf(10 μg/l), scf 10 μg/l, il?3 10 μg/l，脐血cd34+细胞终浓度1×105/ml，50 μl/孔，种入96孔培养板，每组平行3孔，重复2板。

(2)脂多糖刺激: 按50 μl/孔，终浓度分别为0 u/ml, 0.1 u/ml, 0.3 u/ml, 1.0 u/ml, 3.0 u/ml, 10 u/ml, 30 u/ml的自制脂多糖及终浓度分别为0 mg/l, 0.1 mg/l, 0.3 mg/l, 1.0 mg/l, 3.0 mg/l, 10 mg/l, 30 mg/l标准脂多糖，分别加入50 μl/孔上述溶液中。

1.3.3 脐血cd34+细胞活力检测 各孔样本混匀，行台盼蓝排斥实验,活性细胞计算公式为:活细胞率(%) = 活细胞总数×100%/(活细胞总数+ 死细胞总数)

1.3.4 mtt试验检测 参照文献[2，3] 进行, 细胞接种于96孔培养板后， 37 ℃、5%co2孵箱中培养3 d，每孔加入mtt(5g/l)20 μl, 继续培养4 h, 离心吸弃培养基，加入dmso 100 μl，于微量振荡器上振荡20 min，待紫色结晶完全溶解后，用m550型elisa reader酶标仪测定各组细胞的a570吸光值, 以0 μmol/l为对照组计算脂多糖作用下脐血cd34+细胞增殖率(er)。增殖率(er)=(用药组a值/对照组a值?1)×100%。计算最佳效应浓度。

1.3.3 实验分组 对照组、自制脂多糖组和标准脂多糖组, 重复1.3.2下(1)步骤, 自制脂多糖组加入终浓度为最佳效应浓度的自制脂多糖, 标准脂多糖组则加入终浓度为最佳效应浓度的标准脂多糖, 对照组不加脂多糖，重复1.3.3及1.3.4步骤，每组平行3孔，重复2板，计算脂多糖作用下脐血cd34+细胞的mtt值。

1.4 统计学处理

用spss软件分析进行方差分析，p<0.05表示差异有显著意义。

2 结果

2.1 不同浓度脂多糖对脐血cd34+细胞体外增殖的影响

通过mtt试验测出脐血cd34+细胞在2种不同浓度脂多糖中的吸光度值，然后根据该值换算成增殖率，绘制浓度?增殖率曲线，从曲线可以看出自制脂多糖在浓度的30 u/ml时，达最大效应，标准脂多糖则在10 μg/l时浓度达最大增殖效应;在最大效应浓度之前，随着脂多糖浓度增加，脐血cd34+细胞的增殖率增加，在最大效应浓度以后，则随着脂多糖浓度的增加，脐血cd34+细胞的增殖率随之降低;自制脂多糖对脐血cd34+细胞细胞增殖的最大效应略高于标准脂多糖，但两者无统计学差异(p>0.05);2种脂多糖对脐血cd34+细胞的增殖效应曲线相仿。见图1。

2.2 最佳效应浓度时脂多糖对脐血cd34+细胞体外增殖的影响

对照组、自制脂多糖组和标准脂多糖组的mtt a值分别为(0.66±0.09)、(2.80±0.32)和(3.05±0.24)。自制脂多糖在浓度30 u/ml、标准脂多糖在浓度10 μg/l时脐血cd34+细胞的mtt值与对照组比较，结果均有显著性差异，p<0.05。两组脂多糖则无显著性差异，p>0.05。

3 讨论

脐血(又称脐带血)含有丰富的造血干/祖细胞，是一种新的极具潜力的干细胞来源[4,5]。但是由于相对成人干细胞移植所需要的量而言，单份脐血干/祖细胞数量又显得不足[6]，限制了脐血在临床的使用。为了拓宽脐血的使用范围，保证单份脐血足够的数量，脐血的造血干/祖细胞的体外扩增具有重要的意义。现在对脐血cd34+细胞体外扩增的研究已经较多，比较公认的、有效的、可靠的方法仍是造血因子支持的体外扩增技术。造血因子种类很多，是一组对造血有调控作用的细胞因子，属于糖蛋白的家族，具有高效性、放大性、专一性、调节性及协同性等特点， gilmore等人[7]的研究发现，用fl+tpo的造血因子组合体外扩增纯化的cd34+细胞16周，cd34+干/祖细胞扩增达100倍，他们还发现scf+fl+tpo+il?6四因子组合，能使脐血细胞长期生长，cd34+细胞产量比fl+tpo高，并提出这四因子组合应是实验室cd34+细胞培养的标准组合。

脂多糖[8,9]是所有革兰氏阴性菌细胞壁上的主要成分，脂质a(lipid a)为构成内毒素活性的糖脂，以共价键联结到杂多糖链，有两部分：核心多糖，在有关的株内是恒定的;o特异性链(o?specific chain)是高度可变的。脂多糖可刺激细胞发生形态代谢及基因表达的改变，但它对脐血cd34+细胞体外增殖能力的影响，目前研究尚不多。本实验通过比较不同浓度自制脂多糖与标准脂多糖对脐血cd34+细胞体外增殖能力的影响，计算其最佳效应浓度，并再次比较它们在最佳效应浓度时对脐血cd34+细胞体外增殖能力的影响，结果显示,2种脂多糖在促进脐血cd34+细胞体外扩增方面作用类似，即低浓度对造血干/祖细胞有生长刺激作用，高浓度则出现抑制效应，这可能与lps参与细胞生长增殖的多因素调节有关[10,11]，在高浓度时，lps可能主要作为干扰素、肿瘤坏死因子的强烈诱导剂，低浓度时这种作为干扰素诱导剂的作用减弱，而作为gm?csf受体表达激活剂的作用增强，从而参与脐血cd34+细胞的激活过程。本文是初筛试验，其机理尚待以后的实验证实。

【参考文献】

1 mao p, zeng jl, wang cx, et al. in vitro expansion of cord blood cd133+ cells supported by bone marrow stromal cells and cytokines[j]. zhongguo shi yan xue ye xue za zhi，2007,15(2):319?323.

2 jiang z, teng gj, chen ba, et al. local effects of retrovirally transduced endostatin?expressing human umbilical cord blood cd34+ cells on transplanted malignancy in a mouse model of hepatic cancer[j]. cell transplant，2008，17(8):969?975.

3 he j, xie xm, jiang dj, et al. differentiation of 2 endothelial progenitor cells in vitro and inhibitory effect of asymmetric dimethylarginine on its proliferation[j]. zhong nan da xue xue bao yi xue ban,2008,33(2):138?145.

4 chivu m, diaconu cc, bleotu c, et al. the comparison of different protocols for expansion of umbilical?cord blood hematopoietic stem cells[j]. j cell mol med,2004, 8(2):223?231.

5 reyftmann l, dechaud h, hamamah s, et al. fetal and umbilical blood cord stem cells: a room for the obstetrician and gynaecologist. part two[j]. gynecol obstet fertil, 2004, 32(11):969?975.

6 tomonari a, iseki t, asano s. umbilical cord blood transplantation[j]. nippon rinsho,2001,59(12): 2433?3438.

7 gilmore gl, depasquale dk, lister j, et al. ex vivo expansion of human umbilical cord blood and peripheral blood cd34(+) hematopoietic stem cells[j].exp hematol,2000, 28(11):1297?1305.

8 niedziela t, dag s, lukasiewicz j, et al. complete lipopolysaccharide of plesiomonas shigelloides o74:h5 (strain cnctc 144/92). 1. structural analysis of the highly hydrophobic lipopolysaccharide, including the o?antigen, its biological repeating unit, the core oligosaccharide, and the linkage between them[j]. biochemistry, 2006,45(35):10422?10433.

9 zdorovenko gm, zdorovenko el, varbanets ld. composition, structure, and biological properties of lipopolysaccharides from different strains of pseudomonas syringae pv[j]. atrofaciens mikrobiologiia,2007,76(6):774?789.

10 刘兴,冯文莉,康格非. 脂多糖受体的研究进展[j]. 国外医学(临床生物化学与检验学分册),2001,22(3): 131?137.

11 闻平. 细菌脂多糖信号胞内传递研究的新进展[j]. 国外医学(临床生物化学与检验学分册),1998,19(3): 115?117.