黑果枸杞中原花青素稳定性和抗氧化性研究

摘要：对黑果枸杞（Lycium ruthenicum）中原花青素的稳定性和抗氧化性进行了研究。结果表明，避光、自然光和日光灯照射条件下，原花青素稳定性很好，不同的温度和pH对原花青素的稳定性影响较大。在较低的温度和pH条件下，原花青素比较稳定；当温度大于50 ℃或pH≥6，原花青素稳定性明显降低。原花青素具有显著的清除・DPPH的能力，当浓度低于0.005 mg/mL时，随浓度增加，原花青素清除自由基的活性逐渐增加，清除率可达到77.26%。

关键词：黑果枸杞（Lycium ruthenicum）；原花青素；稳定性；抗氧化性

中图分类号：S567.1+9；TS255.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）14-3697-04

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.14.039

Abstract： The stability and antioxidation of procyanidins from Lycium Ruthenicum Murray were studied， the results showed that the procyanidins was quite stable under the avoiding light， natural light or low sunlight conditions， and sensitive to temperature and pH. procyanidins was stable under a low temperature and pH， but the stability would decrease quickly when the temperature was above 50 ℃ or pH values above 6. The procyanidins have strong scavenging effects to ・DPPH radicals， and has the highest scavenging activity when the concentration of procyanidins was below 0.005 mg/mL， the clearance rate of ・DPPH was 77.26%.

Key words： Lycium ruthenicum； procyanidins； stability； antioxidation

原花青素是从植物中分离得到的可在热酸处理下产生红色花色素的多酚类化合物[1]，由儿茶素、表儿茶素聚合而成，即黄烷23，42二醇通过C4～C8键或C4～C6键相连形成二聚体、三聚体，乃至十聚体[2]。Masquelier等[3]首次发现了原花青素的抗氧化性能，并从海松皮中成功地提取出原花青素。原花青素是一种天然的自由基清除剂和抗氧化剂，能有效的清除・OH和O・，保护DNA免受・OH引起的氧化损伤，还可以很好的抑制脂质过氧化[4]。因此原花青素被广泛应用到药物、化妆品和功能性食品等领域。

黑果枸杞（Lycium ruthenicum）是茄科枸杞属，中国西北地区所特有的多年生耐盐、抗旱植物，其成熟浆果中富含多种天然类多酚色素物质[5]。目前对于黑果枸杞中原花青素的报道极少，因此，从黑果枸杞中提取原花青素，并研究其稳定性和抗氧化活性，有利于提高黑果枸杞的附加值，为新疆区域经济及植物资源优势的可持续发展提供借鉴，具有广泛的经济效益和社会效益。

1 材料与方法

1.1 材料

黑果枸杞采自新疆帕米尔高原，采摘后，放入烘箱中105 ℃干燥处理并粉碎，粉末放于自封袋中低温避光保存。

儿茶素标样购自中国食品药品鉴定研究所； ・DPPH自由基购自北京中生瑞泰科技有限公司；无水乙醇、浓盐酸、香草醛、柠檬酸、磷酸氢二钠均为分析纯。

1.2 仪器

T6型新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；SHA-C型电热恒温水浴振荡箱，江苏金坛亿通电子有限公司；FA2204N型电子天平，上海明桥精密科学仪器有限公司；SHZ-3型真空泵，河南省巩义市杜甫仪器厂；RE52C型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；恒温培养箱，常州菲普实验仪器厂；HWS24型电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑果枸杞中原花青素的制备 取干燥后的黑果枸杞粉末，在50%乙醇，料液比（g∶mL，下同） 1∶10，50 ℃恒温水浴振荡箱中浸提40 min，抽滤，减压浓缩得原花青素浓缩液，经水适当稀释后，流经大孔吸附树脂进行吸附纯化，收集洗脱液，并减压蒸馏得紫浆，真空干燥得原花青素粉末。

1.3.2 原花青素含量测定 采用浓盐酸-香草醛法[6]，取1 mL原花青素溶液，加入2.5 mL 1%的香草醛-乙醇溶液，再加入2.5 mL浓盐酸，充分混匀后，立即在500 nm波长下测其吸光度，并做空白试验。每个处理平行试验2次，计算平均值。由于吸光度的大小与原花青素含量呈正比，故以吸光度的大小来衡量原花青素的含量。

1.3.3 pH对黑果枸杞原花青素稳定性的影响 将pH为2.2、4.0、6.0、8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液分别加入等量的原花青素水溶液，配制成一定浓度的原花青素溶液，室温避光保存，每隔4 h取样，测定原花青素吸光度的变化，研究pH对原花青素稳定性的影响。

1.3.4 温度对黑果枸杞原花青素稳定性的影响 用黑果枸杞原花青素粉末配制一定浓度的原花青素水溶液，分别将等量原花青素水溶液置于4、25、50、80 ℃条件下，每隔4 h取样，测定原花青素吸光度的变化，研究温度对原花青素稳定性的影响。

1.3.5 光照对黑果枸杞原花青素稳定性的影响 用黑果枸杞原花青素粉末配制一定浓度的原花青素水溶液，分别将等量原花青素水溶液置于避光、自然光和日光灯照射条件下，每隔24 h取样，测定原花青素吸光度的变化，研究光照对原花青素稳定性的影响。

1.3.6 黑果枸杞原花青素对・DPPH清除能力测定 ・DPPH是一种稳定的自由基，在可见光区最大吸收峰为517 nm。当加入自由基清除剂，溶液颜色变浅，吸光度变小，且吸光度变小程度与自由基被清除程度呈线性关系，因此通过吸光度的检测，可评价物质清除自由基的能力。

分别配制浓度为0.001、0.002、0.004、0.005、0.010、0.020、0.050、0.100 mg/mL原花青素乙醇溶液和等浓度的・DPPH乙醇溶液，以样品溶剂加・DPPH乙醇液作为空白管，以样品提取液加乙醇作为对照管，取3.0 mL样品提取液，加入3.0 mL 0.1 mmol/L的・DPPH乙醇溶液，摇匀，在室温避光反应30 min后，测定517 nm下的吸光度。计算原花青素对・DPPH的清除率（K）。

K=[1-（A样品-A对照）/A空白]×100%

2 结果与分析

2.1 黑果枸杞中原花青素稳定性研究

2.1.1 pH对原花青素稳定性的影响 分别将pH为2.2、4.0、6.0、8.0的等量磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液加入到等量的黑果枸杞原花青素水溶液中，混合均匀，室温密封避光保存，每隔4 h，在波长500 nm处测定原花青素水溶液吸光度，试验结果见图1。从图1可知，当在pH为2.2和4.0的偏酸性环境下，原花青素水溶液吸光度无明显改变，原花青素含量基本保持不变。当在偏中性和碱性条件下，随着储存时间的延长，吸光度呈下降趋势，且pH越大，吸光度的降低程度越明显，即原花青素稳定性随pH的增大和储存时间的延长而逐渐减低。这是因为原花青素结构中含有多个酚羟基，使其具有酸性，因而在碱性环境中反应生成其他物质，使其自身发生降解。为了更直观的表示出pH≥6时，原花青素含量与储存时间的变化关系，做出了不同pH对原花青素稳定性影响的趋势（图2）。由图2可知，吸光度与储存时间呈明显的线性关系（R2分别为0.988 0和0.986 2），通过回归方程，可计算出在特定pH时，不同储存时间原花青素的含量，这对于预测原花青素在不同储存条件下含量的变化具有良好的借鉴作用。

2.1.2 温度对原花青素稳定性的影响 配制一定浓度等量的原花青素水溶液，分别置于4、25、50、80 ℃条件下，每隔4 h取样，在500 nm处测定其吸光度，结果见图3。由图3可知，当原花青素溶液保存于4 ℃条件下，吸光度保持恒定，当置于25 ℃（室温）条件下，其吸光度略有降低，但降低趋势不明显。由于原花青素对热敏感，当分别置于50 ℃和 80 ℃条件下，随着保存时间的延长，吸光度呈明显降低趋势，且温度越高，吸光度降低越快。在50 ℃和80 ℃条件下，原花青素水溶液吸光度与保存时间的趋势见图4。由图4可知，其吸光度的变化与保存时间呈良好线性关系（R2分别为0.984 5和0.991 7），这对不同储存时间下黑果枸杞中原花青素的含量变化具有很好的预测能力。

2.1.3 光照对原花青素稳定性的影响 在室温条件下，分别将等量的相同浓度的原花青素水溶液置于避光、自然光与日光灯照射（26 lx）条件下，每隔24 h取样，测定其吸光度，结果见图5。由图5可以看出，随着储存时间延长，三组不同光照处理条件下，原花青素溶液的吸光度均未明显降低，表明原花青素含量变化较小，因此，在特定储存条件下，避光、自然光和日光灯对黑果枸杞中原花青素的稳定性均无明显影响。

2.2 黑果枸杞中原花青素抗氧化活性研究

研究通过原花青素对・DPPH的清除能力来检测黑果枸杞中原花青素的抗氧化活，结果见表1和图6。由表1和图6可知，黑果枸杞中原花青素具有很强的清除自由基功能，当浓度低于0.005 mg/mL时，随浓度增加，原花青素清除自由基的能力逐渐增强，清除自由基能力明显，其抗氧化能力显示出一定的量效关系，清除率可达到77.26%；当浓度大于0.010 mg/mL时，随浓度增大，原花青素清除 ・DPPH的能力增加缓慢。这与蒋其忠[6]和罗贯中[7]的研究结果趋势一致，但黑果枸杞中原花青素清除・DPPH的能力明显优于茶子壳和葡萄子中原花青素清除自由基的能力。这可能与不同原料中原花青素的聚合度有关，研究认为，原花青素2～3聚体抗脂质过氧化能力最强，5～6聚体清除超氧阴离子能力最强[8]。

3 小结

利用不同pH、温度和光照条件对原花青素稳定性进行研究。结果表明，在较低温度和pH条件下，黑果枸杞中原花青素稳定性较好；随着温度的升高和pH的增大，原花青素稳定性逐渐降低；不同的光照处理对黑果枸杞中原花青素稳定性无明显影响。通过黑果枸杞中原花青素对・DPPH的清除能力测定，表明黑果枸杞中原花青素具有良好的清除自由基功能，当浓度低于0.005 mg/mL时，随浓度增加，原花青素清除自由基的活性逐渐增强，清除率可达到77.26%，当浓度大于0.010 mg/mL时，原花青素清除・DPPH的能力增加缓慢。

参考文献：

[1] JAME A K，GRAHAM P J. Analysis of proanthocyanidin cleavage products of following acidcatalysis in the presence of excess phloroglucinol[J].Agric Food Chem，2001，49：1740-1746.

[2] YAHARA N，TOFANI I，MAKI K，et al. Mechanical assessment of effects of rape seed proanthocyanidins extract on tibial bone diaphysis in rats[J].J Musculoskelet Neuronal Interact，2005， 5（2）：162-169.

[3] MASQUELIER J，MICHAUD J，LAPARRA J.Flavonoides etpycnogenols[J].Int J Vitam Nutr Res，1979，49：307-311.

[4] 赵 平，任 鹏，张月萍.原花青素抗氧化活性测定方法比较[J].现代化工，2012，32（5）：119-122.

[5] 陈海魁，蒲凌奎，曹君迈，等.黑果枸杞的研究现状及其开发利用[J].黑龙江农业科学，2008，12（5）：155-157.

[6] 蒋其忠.茶籽壳原花青素的分离纯化、稳定性及抗氧化活性研究[D].合肥：安徽农业大学，2010.

[7] 罗贯中.原花青素的提取、分离机抗氧化性、稳定性的研究[D].天津：天津科技大学，2006.

[8] BOS M A，VENNAT B，MEUNIER M T，et al. Procyanidins from tormentil：Antioxidant properties towards lipoperoxidation and anti-elastase activity[J].Biol Pharm Bull，1996，19（1）：146-148.