姜黄素抑制视网膜色素上皮细胞增生的实验研究

【摘要】 目的：观察姜黄素对碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）促进人视网膜色素上皮细胞（RPE）增殖的抑制作用。方法：取体外培养的人RPE细胞，分为空白组（加入1%小牛血清培养液）、对照组（加入1%小牛血清及5 ng/ml bFGF的DMEM培养液）和实验组（加入1%小牛血清、5 ng/ml bFGF及加入5、10、20 mg/L姜黄素的DMEM培养液），MTT法检测姜黄素对bFGF促进的RPE细胞表达的影响。结果：10 mg/L处理组48 h和20 mg/L处理组24、48 h均能显著抑制bFGF诱导的RPE增殖（P

【关键词】 姜黄素； 碱性成纤维细胞生长因子； 视网膜色素上皮细胞

中图分类号 R774.1 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2014）7-0148-02

姜黄素具有抗感染、抗氧化、抗增殖作用，还可以抑制肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞凋亡，可以抑制RPE细胞的增殖。本实验观察姜黄素对碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）促进人RPE增殖的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 RPE细胞

来源于笔者所在医院孕24周以上引产胎儿眼。

1.2 试剂

改良的Eagle培养基干粉（DMEM，美国Gibco公司生产）、胰蛋白酶（美国Sigma公司生产）、新生小牛血清（武汉博士德生物工程有限公司生产）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） （美国Promega公司生产）、姜黄素（成都司科华生物技术有限公司生产），其余试剂为国产分析纯。

1.3 实验仪器

低温高速离心机5417R型（德国Epondof公司生产）、CO2恒温培养箱MCO175型（日本SANYO公司生产）、相差显微镜（上海团结仪器制造厂生产）、全自动酶标仪960型（美国Sigma公司生产）、超低温冰箱（日本SANYO公司生产）、荧光倒置显微镜U-LH100HG型（日本Olympus公司生产）。

1.4 方法

1.4.1 人RPE细胞的获取 人RPE细胞取自供体眼球，在无菌条件下剖开眼球，弃去玻璃体和视网膜神经上皮，剪除神经上皮，制成眼杯。用PBS液漂洗眼杯，加2 ml 0.25%胰酶消化液，10 min后，吸出消化液，再加入2 ml消化液，在37 ℃条件下消化30 min，将所得细胞悬液加入含15%小牛血清培养基的离心管中。1000 r/min离心5 min后，弃上清，漂洗，加入5 ml含15%小牛血清的DMEM培养瓶中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，根据培养液颜色决定换液时间，待细胞生长至融合状态后开始常规传代，取第二代RPE细胞进行鉴定。

1.4.2 姜黄素对RPE细胞增殖的影响 采用MTT法检测，取第四代RPE细胞用1%小牛血清的DMEM稀释成1×105个/ml的细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100 μl，置于37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中，培养24 h后换液。本研究设空白组（加入1%小牛血清培养液）、对照组（加入1%小牛血清及5 ng/ml bFGF的DMEM培养液）和实验组（加入1%小牛血清、5 ng/ml bFGF及加入5、10、20 mg/L姜黄素的DMEM培养液）。分别培养24 h和48 h后每孔中加入200 μl MTT继续培养4 h，吸出上清液，加入150 μl DMSO，慢慢振荡使MTT完全溶解，使用自动酶标检测仪测定各孔吸光度（A）值。实验每组设3个平行样，重复3次。增殖抑制率=（对照组A值-实验组A值）/对照组A值×100%。

1.4.3 细胞形态学观察 在相差显微镜下观察细胞形态。

1.5 统计学处理

所得数据采用SPSS 16.0统计学软件进行处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，计数资料采用字2检验，P

2 结果

2.1 RPE细胞培养及鉴定

在相差显微镜下初次分离的原代 RPE 细胞呈球形，胞浆中可看到大量黑色素颗粒，胞核透明。培养2～4 d后细胞贴壁变扁平，开始伸出伪足，呈不规则多角形，形态均一。传代后，胞浆中色素颗粒开始减少，传至3～4代后，胞浆内的黑色素颗粒消失，细胞向梭形方向发展。第4代RPE细胞经鼠抗人角蛋白染色鉴定，纯度>95%。

2.2 姜黄素对RPE细胞形态的影响

正常培养的RPE细胞呈现多角形、梭形或扁圆形贴壁生长，bFGF处理组可见细胞增殖较快。加入5 mg/L姜黄素组24 h和48 h细胞形态未见明显异常，加入10 mg/L处理组24 h和加入20 mg/L处理组12 h可见有细胞表面变粗糙、折光性变差，随着时间延长细胞结构变的不清楚，有的皱缩、脱壁。

2.3 姜黄素对RPE细胞增殖的影响

MTT检测结果可以看出，5 mg/L处理组24、48 h和10 mg/L处理组 24 h对bFGF促进的RPE细胞增殖未见明显的抑制作用，10 mg/L处理组48 h和20 mg/L处理组24、48 h均能显著抑制bFGF诱导的RPE增殖（P

3 讨论

孔源性视网膜脱离复位手术后视网膜表面发生的广泛纤维增殖，引起视网膜收缩、牵拉，进而引起脱离称为增生性玻璃体视网膜病变（PVR）。增殖的纤维膜主要由色素上皮细胞（RPE）、纤维细胞、成纤维细胞、胶质细胞和巨噬细胞构成，其中最主要的为色素上皮细胞。研究发现，生长因子、白细胞介素、黏附分子等都参与调节RPE细胞和成纤维细胞的迁移与增殖，可以用药物抑制细胞增生而达到预防PVR的发生[1]。

姜黄素具有抗感染、抗氧化、抗增殖作用，其对RPE细胞也有抑制作用。龚凌等[2]研究发现姜黄素对体外培养的人胚眼RPE细胞的增殖有抑制作用，且抑制作用具有时间依赖性[3]。研究发现，在视网膜脱离合并PVR患者的玻璃体液中碱性成纤维生长因子（bFGF）含量增高，并且bFGF对RPE细胞增殖有促进作用[4]，所以本实验中模拟使用bFGF促进RPE细胞的增殖，具有代表性。本研究中，在24 h时，姜黄素浓度为10、20 mg/L组均能抑制bFGF所促进的人RPE细胞的增殖。48 h时5、10、20 mg/L姜黄素亦能抑制bFGF所促进的人RPE细胞的增殖。说明低浓度姜黄素即对bFGF所促进的人RPE细胞的增殖有抑制作用，但是本研究未对细胞毒作用做观察，同时姜黄素对不同种属、不同来源的细胞有无抑制作用也未做观察，有待进一步研究。

参考文献

[1]杨俊.姜黄素对bFGF诱导的人视网膜色素上皮细胞增殖的影响[D].南宁：广西医科大学，2007.

[2]龚凌，姜德咏，朱晓华，等.姜黄素对培养的人胚胎视网膜色素上皮细胞增殖活性的影响[J].眼科学报，2004，20（4）：246-248.

[3]安建斌，马景学，高彦军，等.姜黄素抑制兔视网膜色素上皮细胞增生的机制研究[C].中国研讨会论坛・全国眼底病专题学术研讨会论文汇编，2008.

[4]黄秀榕，祁明信，康可人.姜黄素诱导牛晶状体上皮细胞凋亡的机制[J].中华眼科杂志，2006，42（7）：649-653.

（收稿日期：2013-11-16） （编辑：韩珊珊）