3种不同基原藏药沙棘的1H―NMR代谢组学研究

[摘要] 运用1H-NMR代谢组学方法，建立藏药沙棘的氢核磁共振指纹图谱，明确不同基原之间的整体代谢物差异，为其质量评价提供新方法。利用核磁共振仪测定不同基原的沙棘药材，将所得自由衰减信号导入MestReNova软件进行分段积分，数据归一化后进行主成分（PCA）分析和偏最小二乘法（PLS-DA）分析，结果显示3种不同品种沙棘能够明显分开，L-白雀木醇、苹果酸和部分未鉴定的糖类成分是引起3个品种分类的差异代谢物。该研究鉴定出25个代谢产物，包括黄酮类、三萜类、氨基酸类、糖类、脂肪酸类等成分。1H-NMR分析方法具有整体性的特征，并且样品制备简单、分析快速、重复性好，建立的指纹图可以为藏药沙棘药材的质量控制与评价提供参考依据。

[关键词] 藏药沙棘； 1H-NMR代谢组学；化学计量学；质量控制

沙棘为胡颓子科植物沙棘Hippophae rhamnoides L.的干燥成熟果实，具有健脾消食，止咳化痰，活血化瘀之功效，常用于脾虚食少，咳嗽痰多，胸痹心痛，跌打瘀肿等[1]。沙棘属植物品种繁多，分布地域广泛，不同品种分布地域区间跨度大，这些因素直接导致了沙棘药材基原的复杂性[2-4]。目前沙棘药材的质量控制主要是采用HPLC对黄酮类成分进行含量测定或指纹图研究[5-6]。1H-NMR的优势在于能较全面的检测药材的整体化学成分，测定快速准确，专属性强等。1H-NMR代谢组学技术已成功应用于人参[7]、黄连[8]、泽泻[9]等药材质量控制与评价。本文采用1H-NMR代谢物组学技术，研究中国沙棘H. rhamnoides L. subsp.sinensis Rousi.、沙棘H.tibetana Schlechtend.、江孜沙棘H. rhamnoides L.subsp. gyantsensis Rousi药材的代谢成分，结合PCA，PLS-DA等化学计量学方法研究不同基原沙棘药材的代谢物差异，最终建立其代谢指纹图谱，找出引起种间差异性的标志物，为藏药沙棘药材的质量控制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器、软件和试药

Agilent Technologies 600/54 Premium Compact（600 MHz） 核磁共振波谱仪（美国Agilent公司）；MestReNova（version 9.0， Mestrelabs Research SL， Santiago de Compostela， Spain） 软件， SIMCA-P（version 11.5， Umetrics， Ume， Sweden）软件，Sartorius BP 221 S电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；KQ-300 B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；微孔滤膜（天津津腾实验设备有限公司，孔径0.45 μm，有机系）；氘代甲醇、重水（色谱纯，北京京云重轻科技有限公司），3-三甲基甲硅烷基-2，2，3，3-四氘代丙酸钠（TSP，美国Sigma-Aldrich公司）；槲皮素、山柰素、异鼠李素、异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷对照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批号分别为H-009-130126，S-064―130518，Y-039-130326，S-063-130114）；槲皮素-3-O-β-D-芸香糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、齐墩果酸对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号分别为MUST-13040302，MUST-13021811，MUST-13022011，MUST-13041606）。

1.2 沙棘药材来源

本研究主要收集了四川、甘肃、青海、4个不同产地的沙棘药材，共42个批次，药材经成都中医药大学民族医药学院张艺研究员鉴定为胡颓子科植物沙棘中国沙棘H. rhamnoides L. subsp.sinensis Rousi.、沙棘H.tibetana Schlechtend.、江孜沙棘H. rhamnoides L.subsp. gyantsensis Rousi的干燥成熟果实，详见表1。

1.3 方法

1.3.1 供试品溶液的制备 取干燥的药材粉末0.2 g，置于锥形瓶中，分别加入0.3 mL D2O溶液（内含12.32 g・L-1 KH2PO4和0.04% TSP）和1 mL CD3OD，密封，超声提取30 min，取出，放冷，过0.45 μm微孔滤膜，精密吸取0.6 mL滤液至标准的5 mm核磁管中，待测。

1.3.2 1H-NMR测定条件 测定温度 25 ℃；观察频率 600 MHz；各项参数扫描次数（nt）128；谱线宽度（lb）0.5 Hz；弛豫时间（d1）2 s；FID转换所需点数（fn）65 536；FID信号采集时间（at）1.703 9 s；谱宽（sw）9 615.4 Hz；调用水峰压制序列（Presat）压制水峰信号，总测定时间为9 min 5 s。

1.3.3 数据处理 将经NMR仪检测得到的1H-NMR 自由衰减（FID）信号导入MestReNova 软件进行自动傅立叶转换，手动调整相位与基线，以内标物TSP为基准校正化学位移，选择δ 0.5～10.5范围的1H-NMR图并以每δ 0.04作为1个单位进行分段积分，并对总峰面积作归一化处理，最后以ASCII格式输出数据，得到各化学位移段与之相对应的信号峰面积值。本试验共获得242段积分（扣除2段甲醇峰信号δ 3.26～3.34和4段水峰信号δ 4.74～4.90）。将获得的数据矩阵（242个变量×42个样品），导入 SIMCA-P软件进行PCA分析与PLS-DA分析。

1.3.4 方法学考察 代谢物组学研究的主要内容是凭借化学计量学方法对不同样品间的相似度或差异性进行评价[10]。在实验进行的过程中，供试品溶液的提取制备以及仪器测量等因素都易产生误差，进而对实验分析结果产生影响，所以，在代谢物组学的研究过程中，针对方法重复性的考察显得尤为重要。

为了同时考察仪器测量和供试品的提取制备的重复性，本研究选取了4批不同的沙棘药材，每批药材按“供试品溶液制备”项下的方法分别提取制备4次，依次进行1H-NMR测定，然后，每批药材均随机抽取1个提取液平行进行测定5次。最后，分别进行数据处理，将得到的数据矩阵（242个变量×9个样品）导入SIMCA-P软件进行PCA分析。结果见图1。

根据主成分分析的投影图，四批沙棘药材都完全可以明显的进行区分，这表明由于仪器测量和沙棘供试品溶液的制备所引起的误差均比较小，从图中不难看出，药材间化学成分的不同是引起最大差异的主要原因。结果表明，本实验所建立起来的沙棘药材代谢物组学的方法重复性良好，沙棘药材样品之间的差异性分析结果不会被样品提取、仪器测量、数据处理等外在因素的影响。

1.3.5 1H-NMR信号归属 主要采用 “加标准品定性”试验以及根据参考文[11]献数据比对的方法进行沙棘药材提取物代表性的1H-NMR指纹图信号归属。从沙棘药材提取物中一共鉴定出25个化合物，其中槲皮素、山奈素、异鼠李素、齐墩果酸、槲皮素-3-O-β-D-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷8个成分采用“加标准品定性”试验确定，异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、奎宁酸、苹果酸、胆碱、L-白雀木醇、脱氢抗坏血酸、蔗糖、尿苷、色氨酸、组氨酸、葫芦巴碱、饱和脂肪酸类、不饱和脂肪酸类、甾醇类17个成分根据参考文献数据对比鉴定。

1.3.6 数据分析 采用PCA分析方法和PLS-DA方法进行模式识别分析。

2 结果

2.1 沙棘药材提取物代表性的1H-NMR图测定及其代谢成分的直观分析

中国沙棘、沙棘和江孜沙棘的特征代谢指纹图见图2。通过直观分析，可以看到3个基原品种沙棘药材的代谢物轮廓大致相同，均含有黄酮类、糖类、有机酸类和脂肪酸类成分。但不同基原的一些信号峰的强度存在着一定差异，如江孜沙棘的脂肪酸信号明显强于中国沙棘和沙棘，而江孜沙棘的苹果酸信号则明显弱于其他2个品种；同时可以发现，在δ 5.0～9.0的芳香区域中，沙棘在该区域中的信号峰强度明显弱于其他2个品种，表明3个基原品种间的代谢成分含量有一定的差异。

2.2 沙棘药材提取物代表性的1H-NMR信号归属及代谢物鉴定

本实验从沙棘药材提取物中一共鉴定出25个化合物，包括3个黄酮类成分，4个黄酮苷类成分，1个三萜类成分， 8个氨基酸类成分，1个糖类成分、1个生物碱类成分和7个其他类成分。

25个成分的1H-NMR特征信号峰δ值及多重态分别为槲皮素δ：7.72（d，J=8.9 Hz），7.63（m），7.59（m），6.93（m），6.44（d，J=8.7 Hz），6.24（s）；山柰素δ：8.06（m），6.93（m），6.44（d，J=8.7 Hz），6.24（s）；异鼠李素δ：7.83（d，J=11.9 Hz），7.72（d，J=8.9 Hz），6.97（s），6.44（d，J=8.7 Hz），6.24（s），3.96（s）；槲皮素-3-O-β-D-芸香糖苷δ：7.68（d，J=12.1 Hz），7.63（m），7.59（m），6.93（m），6.47（d，J=9.4 Hz），6.27（s）；槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷δ：7.72（d，J=8.9 Hz），7.59（m），6.97（s），6.47（d，J=9.4 Hz），6.27（s），5.15（d，J=3.4 Hz）；异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷δ：7.90（d，J=6.7 Hz），7.63（m），6.97（s），6.47（d，J=9.4 Hz），6.27（s），5.17（d，J=6.9 Hz），4.53（d，J=7.9 Hz），3.96（s），1.08（d，J=5.3 Hz）；异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷δ：7.87（m），7.59（m），6.97（s），6.47（d，J=9.4 Hz），6.27（s），3.95（s）；齐墩果酸δ：5.22（s），1.10（s），0.95（s），0.91（s），0.90（s），0.76（s），0.75（s）；异亮氨酸δ：1.00（d，J=6.5 Hz），0.97（d，J=6.8 Hz）；亮氨酸δ：0.97（d，J=6.8 Hz）；缬氨酸δ：1.01（d，J=5.5 Hz），1.00（d，J=6.5 Hz）；丙氨酸δ：1.49（d，J=7.2 Hz）；奎宁酸δ：1.88（dd，J=20.5 Hz，J=8.7 Hz）， 2.23～1.98（m），4.15（m）；苹果酸δ：4.46（m），2.82（dd，J=16.2 Hz， J=4.1 Hz） 2.68（dd，J=16.2 Hz， J=7.3 Hz）；胆碱δ：3.20（s）；L-白雀木醇δ：3.45（s），3.63（m）；脱氢抗坏血酸δ：4.63（dd，J=8.5 Hz，J=3.5 Hz），4.68（m）；蔗糖δ：5.38（d，J=3.7 Hz）；尿苷δ：7.90（d，J=6.7 Hz），5.95～5.87（m）；色氨酸δ：7.72（d，J=8.9 Hz）；组氨酸δ：8.67（d，J=1.4 Hz）；葫芦巴碱δ：9.17（s），8.85（d，J=6.3 Hz），8.88（d，J=8.4 Hz）；饱和脂肪酸类δ：0.88（m），1.24～1.35（m），1.57（m），2.52（t，J=7.4 Hz）；不饱和脂肪酸类δ：0.88（m），1.24～1.35（m），1.57（m），2.29（m），2.52（t，J=7.4 Hz），5.34（m）；甾醇类δ：0.69（s）。

2.3 基于多元统计分析方法的不同基原沙棘药材代谢成分差异研究

2.3.1 主成分分析 本实验沙棘样品共42批，每份供试品溶液平行测定3次。将126×242数据矩阵导入SIMCA-P软件进行主成分分析，主成分分析得分图见图3。结果显示，前2个主成分的累积贡献率为93%（PC1 86%，PC 27%），即表明前2个主成分就能概括原数据242个变量的93%的信息量。由第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）得到的得分图可知，中国沙棘与其他2个基原品种在PC1轴上能够明显区分开来，同时，中国沙棘、沙棘、江孜沙棘3个基原皆能被PC1和PC2分为3组，每1组即对应1个基原品种，说明3种基原品种沙棘药材之间的代谢成分有着明显的差异。

为便于找到引起3个基原品种分类的内在原因，发现可以作为鉴别的内在代谢标志物，本文进一步针对PC1与PC2进载荷图分析，载荷图（图4）表明，L-白雀木醇、蔗糖、奎宁酸、苹果酸和脂肪酸类成分是造成3个品种分类的差异代谢物。对应观察载荷图与得分图，根据代谢成分在PC1轴上的载荷值，可得出结论：中国沙棘和江孜沙棘比较，中国沙棘中L-白雀木醇、蔗糖和脂肪酸类成分含量较高，苹果酸含量较低。另外，根据代谢成分在PC2轴上的分布，可知沙棘和江孜沙棘的代谢成分亦存在差异，沙棘药材中脂肪酸和苹果酸含量较高，而江孜沙棘药材中L-白雀木醇、蔗糖和奎宁酸含量较高。

2.3.2 偏最小二乘法分析 将本实验获得的42×242的数据矩阵导入SIMCA-P软件中，先采用中心化法对数据进行尺度均一化处理，然后再进行偏最小二乘法判别分析。偏最小二乘法判别分析得分3D图和载荷图分别见图5，6。

PLS-DA得分图显示，根据代谢成分在PC1轴上的载荷值，可得出结论：中国沙棘和沙棘比较，中国沙棘中L-白雀木醇、蔗糖和脂肪酸类成分含量较高，苹果酸含量较低。而根据代谢成分在PC2轴上的分布，可知沙棘和江孜沙棘的代谢成分亦存在差异，江孜沙棘药材中L-白雀木醇、蔗糖和奎宁酸含量较高，而沙棘药材中脂肪酸和苹果酸含量较高。3种沙棘药材（中国沙棘、沙棘、江孜沙棘）差异的变量与上述PCA载荷图分析结果基本一致，均可以得到有效区分。

3 讨论

本文采用1H-NMR代谢组学技术，首次同时对3种不同品种沙棘药材整体代谢物进行了检测分析。分析鉴定出25个（类）化合物，包括黄酮类、黄酮苷类、三萜类、氨基酸类、糖类及生物碱类等初生和次生代谢产物。同时结合PCA，PLS-DA等化学计量分析方法，发现了沙棘药材3种不同品种植物的代谢成分有明显的差异。L-白雀木醇、奎宁酸、苹果酸、脂肪酸类成分和部分未鉴定的糖类成分成为中国沙棘、沙棘、江孜沙棘3个品种之间区分开来的代谢标志物。这些特征性代谢产物对于沙棘药材3中不同基原品种的鉴定、质量控制等研究都具有十分重要的意义。

本研究结果表明，与传统的色谱法比较，基于1H-NMR代谢组学技术，是从整体代谢物角度出发，同时检测出沙棘药材中多种代谢成分，克服了常规HPLC不能检测出糖类和脂肪酸类等初生代谢产物的缺陷。运用1H-NMR代谢组学方法结合PCA和PLS-DA等化学计量学的分析方法，为沙棘属药用植物的品种的鉴别和质量评价提供了新思路。

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Study on three different species tibetan medicine sea buckthorn by

1H-NMR-based metabonomics

SU Yong-wen1， TAN Er1， ZHANG Jing 1*， YOU Jia-li1， LIU yue1， LIU Chuan1， ZHOU Xiang-dong2， ZHANG Yi1

（1. College of Ethnomedicine， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China；

2. Department of Medicinal Chemistry， College of Pharmacy， Third Military Medical University， Chongqing 400038， China）

[Abstract] The 1H-NMR fingerprints of three different species tibetan medicine sea buckthorn were established by 1H-HMR metabolomics to find out different motablism which could provide a new method for the quality evaluation of sea buckthorn. The obtained free induction decay（FID） signal will be imported into MestReNova software and into divide segments. The data will be normalized and processed by principal component analysis and partial least squares discriminant analysis to perform pattern recognition. The results showed that 25 metabolites belonging to different chemical types were detected from sea buckthorn，including flavonoids， triterpenoids， amino acids， carbohydrates， fatty acids， etc. PCA and PLS-DA analysis showed three different varieties of sea buckthorn that can be clearly separated by the content of L-quebrachitol， malic acid and some unidentified sugars， which can be used as the differences metabolites of three species of sea buckthorn. 1H-NMR-based metabonomics method had a holistic characteristic with sample preparation and handling. The results of this study can offer an important reference for the species identification and quality control of sea buckthorn.

[Key words] Tibetan medicine sea buckthorn； 1H-NMR metabolomics； chemometrics； quality control

doi：10.4268/cjcmm20142129