COX-2基因沉默对人胃癌细胞系SGC-7901裸鼠成瘤的影响

[摘要]目的 研究COX-2基因沉默对人胃癌细胞系SGC-7901裸鼠成瘤的影响。方法构建靶向COX-2的短发夹状双链RNA(shRNA)的真核表达质粒转染人胃癌细胞系SGC-7901，采用RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果。15只裸鼠随机分为3组，每组5只，皮下接种胃癌细胞。抑制组：接种转染抑制质粒的胃癌细胞；正常对照组：接种未转染的胃癌细胞；阴性对照组：接种转染阴性对照质粒的胃癌细胞。接种4周后比较各组裸鼠皮下形成瘤体的大体和病理情况并计算抑瘤率。结果转染靶向COX-2的shRNA抑制质粒后细胞中COX-2的表达被明显抑制，抑制率为70.42％。正常对照组和阴性对照组所有裸鼠均有瘤体形成，平均瘤质量分别为(0.49±0.017)g和(0.49±0.013)g。抑制组仅2只有瘤体形成，平均瘤质量(0.05*0.003)g，与正常对照组相比差别有统计学意义(P

[关键词]RNA干扰；COX-2；胃癌；细胞系；裸鼠

[中图分类号]R-33，R735.2　[文献标识码]A [文章编号]1671―7562(2007)05―0351―05

研究表明环氧化酶-2(COX-2)在多种肿瘤发生的早期即呈高表达状态，且与肿瘤的发生发展关系密切。通过抑制COX-2蛋白的表达来预防和治疗相关的肿瘤是近年来研究的热点。RNA干扰(RNAi)是指转录后由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)介导的同源序列mRNA的特异性降解，从而导致相应基因表达减少(knock down)或沉默(gene silencing)。本实验中我们希望利用RNAi技术，通过构建表达靶向COX-2的短发夹状双链RNA(shRNA)的表达质粒，转染人胃癌细胞系SGC-7901，抑制细胞中COX-2的表达，研究COX-2基因沉默对人胃癌细胞系SGC-7901裸鼠成瘤的影响。

1　材料与方法

1．1　材料和试剂

无特殊致病原(SPF)级裸小鼠BALB／CAnu品系15只，4周龄，均为雌性(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供)。靶向COX-2的shRNA干扰质粒WBH1由武汉晶赛生物工程技术公司协助设计构建，其靶向干扰序列为5′-AAGTGCGATTGTACCCGGACA-3′。DNA引物的前向序列为5′-GATCCGTGCGATTGTACCCGGACATTCAAGACGTGTCCGGGTACAATCGCACTFTTTTGAATTCA-3′，反向序列为3′-GCACGCTAACATGGGCCTGTAAGTTCTGCACAGGCCCATGTTAGCGTGAAAAAACTTAAGTTCGA-5′。同时设计一条经BLAST与现有基因文库中所有人源基因均无同源性的非特异性序列5′-GACTTCATAAGGCGCATGC-3′，构建阴性对照质粒，称为HK。中分化人胃腺癌细胞系SGC-7901为本实验室自备。RPMI 1640培养基购自武汉亚法生物公司。小牛血清购自北京中山生物技术有限公司。转染试剂阳离子脂质体METAFECTENE购自Biontex公司，细胞裂解液和底物化学荧光自显影试剂盒购自PIERCE公司，COX-2、actin羊抗人多克隆一抗和辣根酶标记兔抗山羊IgG购自Santa Cruz公司。

1．2　方法

1．2．1　细胞培养。胃腺癌细胞系SGC-7901，以含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37℃、体积分数为5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养。待细胞汇片基本铺满瓶底时传代。

1．2．2　细胞转染。将人胃癌细胞系SGC-7901接种于六孔板中，每孔加入含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基2ml。置二氧化碳培养箱中培养(37℃，5％CO2)，隔日更换培养液。待细胞汇片至80％时，用无血清RPMI 1640培养基洗3遍。将质粒和阳离子脂质体按照每1μg质粒加入5μl脂质体的比例混合于无血清RPMI 1640培养基中，室温静置15min，然后均匀滴加入六孔板，每孔200μl。3h后更换为含血清培养基，48h后荧光显微镜下观察转染情况。

1．2．3　抑制效果检测。采用RT-PCR和Western blot两种方法分别检测细胞中COX-2 mRNA和蛋白质含量。实验分3组，分别为转染质粒WBHI的细胞组、转染阴性对照质粒HK的细胞组和未转染细胞组。用常规RT-PCR法扩增各组细胞中的COX-2 mRNA，β-actin作为内参照。COX-2上游引物为5′-TCAAGTCCCTGAGCATCTAC-3′，下游引物为5’一CATrCCTACCACCAGCAACC-3′，产物为488bp。β-actin上游引物为5-GAAACTACCTrCAACTCCATC-3′，下游引物为5′-CGAGGCCAGGATGGAGCCGCC-3′，产物219bp。94℃变性，55℃退火，72℃延伸，共35个循环。用细胞裂解液提取以上各组细胞的总蛋白，加热变性后10％SDS-PAGE电泳分离，电转移至PVDF膜上，用含5％脱脂奶粉的Tris盐溶液封闭2h，加入COX-2羊抗人多克隆一抗(1:200)，4℃孵育过夜。用含吐温-20的Tris盐溶液洗膜(3次，每次10min)后加入辣根过氧化物酶标记的兔抗羊二抗(1:2000)，室温下孵育1h。化学发光法(ECL)检测条带。actin作为内参照。以上实验均重复超过3次。

1．2．4　裸鼠成瘤实验。转染48h后收获细胞，制成细胞悬液，流式细胞仪(FAC Soa-BD，USA)分选纯化。冷PBS洗涤，0.4％台盼蓝染色，记数活细胞数；当活细胞比率>95％，调整细胞浓度至4×106个・m-1，按每只裸鼠0.2ml腹股沟皮下接种。15只裸鼠随机分为3组，分别接种转染WBHI质粒细胞(抑制组)、转染阴性对照质粒HK细胞(阴性对照组)和未转染细胞(正常对照组)，每组5只。实验过程均在SPF屏障环境内进行。接种4周后，观察各组裸鼠成瘤情况，比较成瘤率。断颈处死裸鼠，从皮下完整剥离取出肿瘤组织，比较各组裸鼠瘤体的大小和瘤质量。按下列公式计算抑瘤率：抑瘤率(％)：(正常对照组平均瘤质量一抑制组平均瘤质量)／正常对照组平均瘤质量×100％。将瘤组织切片，苏木精―伊红(HE)染色，光镜下观察病理形态。

1．2．5　统计学处理，采用SPSS13.0统计软件，运用

Oneway-ANOVA方法进行单因素多组间差异的比较，运用t检验进行两组间比较。P

2　结果

2．1　细胞转染情况

质粒中含有编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因，故转染细胞在荧光显微镜下可激发出绿色荧光(图1)。相同视野、不同光线下分别计数细胞数，转染率为50％左右。

2．2　COX-2 mRNA的抑制情况

PCR产物2％琼脂糖电泳的结果见图2。与其他各组细胞相比，转染了WBHI质粒的人胃癌细胞中COX-2 mRNA的含量明显减少(P0.05)(图3)。

2．3　COX-2蛋白的抑制情况

COX-2蛋白在SDS-PAGE凝胶电泳中表现为72kD和74kD两条条带(图4)。转染了WBHI质粒的细胞中COX-2蛋白的表达明显受到抑制，结果与RT-PCR结果一致。

2．4裸鼠成瘤情况

接种4周后正常对照组5只裸鼠均有瘤体形成，成瘤率100％，平均瘤质量(0.49±0.017)g，阴性对照组成瘤率也为100％，平均瘤质量(0.49±0.013)g，与正常对照组相比没有统计学差异(P=0.965)。抑制组只有2只裸鼠有瘤体形成，成瘤率仅为40％(2／5)，平均瘤质量(０.05±0.003)g，与正常对照组相比有统计学差异(P

3　讨论

大量研究表明COX-2在多种肿瘤中呈高表达状态，这种高表达状态开始于肿瘤形成的早期阶段，且COX-2通过促血管生成、加速肿瘤细胞增殖、抑制细胞凋亡等在肿瘤的发生发展过程中起到了十分重要的作用。我们希望通过抑制COX-2表达来预防和治疗相关肿瘤。

RNAi为近年来逐渐被人们所认识的一种自然界普遍存在的机体抵御外来侵犯和进化过程中维持自身恒定的机制。基因可以正常转录，但不能积累mRNA，使得基因在转录后水平失活。其抑制作用高效、特异、安全。由于在靶序列的选择时应用BLAST排除了与现有基因文库中所有其他人类基因同源的可能，所以具有高度的特异性。本实验中WBHl干扰质粒仅抑制了细胞中COX-2的表达，对actin的表达无抑制作用；我们设计的阴性对照质粒HK转染细胞后未对胃癌细胞的生物活性产生任何影响，说明RNAi具有高度特异性。脂质体的细胞转染率为50％，而对COX-2的抑制达到70.42％，说明RNAi的抑制效率很高，抑制作用可以在细胞间传递。实验中所有移植裸鼠均正常存活，未发生一例治疗相关性死亡，说明RNAi有很高的安全性。

裸鼠移植瘤模型是在体研究肿瘤生物效应和抗肿瘤实验治疗的重要工具，具有稳定和简便易行的特点。皮下接种的肿瘤细胞一般呈球形生长，有完整的包膜，且不易发生远处转移。裸小鼠先天性无胸腺，仅有胸腺残迹或异常的胸腺上皮，这种上皮不能使T细胞正常分化，不能执行正常T细胞功能。由于缺乏成熟T细胞的辅助、抑制及杀伤功能，细胞免疫力低下，使得异种移植成为可能，但同时也使我们无法观察到肿瘤细胞在机体完整免疫功能状态下的生长和被抑制情况。因此我们仍有必要进一步探讨与人体正常生理功能更加接近的动物模型。本实验中裸鼠皮下瘤体较小，均小于1g，考虑与皮下接种时间较短(小于1个月)有关。

本实验我们通过构建靶向COX-2的shRNA表达质粒，采用脂质体转染人胃癌细胞系SGC-7901，成功地抑制了细胞中COX-2的表达。COX-2被抑制后SGC-7901的生长和活性也被明显抑制。5只裸鼠仅2只有瘤体形成，成瘤率40％(2／5)，抑瘤率更高达89.8％。因此，我们有理由相信可以通过抑制COX-2表达来预防和限制COX-2高表达肿瘤的发生和发展。

目前的研究普遍采用的是COX-2选择性或非选择性抑制剂，但现有的COX-2抑制剂属于翻译后调节，其对COX-2的抑制为剂量依赖性，抑制效率有限，对肿瘤的抑制作用(抑瘤率)随剂量不同而波动于40％～82％。由于对维持机体正常生理功能的COX-1或多或少也有抑制作用，并不能做到真正意义的特异性抑制，因此人们对于现有的一些COX-2选择性抑制剂的抑瘤作用是否为单纯的COX-2依赖途径尚存在争论，我们的实验采用RNAi的方法，可以达到真正意义的特异性抑制，而且抑制效率和对肿瘤的抑制作用均好于COX-2选择性抑制剂。

综上所述，通过应用RNAi的方法抑制COX-2的表达来预防和治疗COX-2高表达肿瘤具有高效、特异、安全的特点，是切实可行的，值得进一步研究。