胰高血糖素对断奶猪的影响

本文作者：蒋 义 贾 刚 惠明弟 陈小玲 李 华 王康宁 单位：四川农业大学动物营养研究所 农业部动物抗病营养与饲料重点实验室

紧密连接(tightjunction，TJ)是肠道上皮细胞间重要的连接方式，在肠道屏障的维护中起着重要作用［1］。最新研究发现，仔猪早期断奶导致肠道屏障功能受损可能与断奶导致的肠道紧密连接受损有关［2］。寻求有效的方式降低和缓解断奶对仔猪肠道紧密连接的损伤，对于提高仔猪肠道屏障功能和缓解仔猪断奶肠道应激具有重要的作用。胰高血糖素样肽－2(glucagon-likepeptide-2，GLP-2)是近年来发现的一种促肠生长激素，其不仅能够促进肠道细胞的增殖、分化，抑制细胞的凋亡［3－4］;还能降低肠上皮的通透性和细菌的黏附率［5］与易位率［6］，使通过跨细胞途径转运的Na+和铬－乙二胺四乙酸(Cr-EDTA)以及辣根过氧化物酶(HRP)的通导量下降［7］。在病理的条件下，已经发现GLP-2能够促进大鼠小肠紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1和Occludin的基因表达［8］。在紧密连接的调控研究中发现，众多生长因子能够通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信号通路调控紧密连接蛋白的表达，实现对细胞或组织屏障功能的调节［9］。但在断奶仔猪上，GLP-2能否通过影响肠道紧密连接相关基因的表达实现对仔猪肠黏膜屏障功能的调节以及其可能的调控机制，目前尚不清楚。因此，本试验以离体培养的断奶仔猪空肠组织为模型，研究GLP-2对断奶仔猪肠道紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1和Occludin的基因表达的影响，并探究GLP-2是否是通过MAPK信号通路调控紧密连接蛋白相关基因表达的，为运用GLP-2缓解断奶仔猪肠道应激、提高肠道屏障功能和促进肠道健康提供理论依据。

1材料与方法

1．1试验对象GLP-2:纯度≥95%(PhoenixPharmaceuticals，美国)。

1．2试验动物试验动物选用28日龄断奶的“杜×长×大”(DLY)健康仔猪6头，试验1屠宰3头，平均体重为(7．28±0．32)kg;试验2屠宰3头，平均体重为(7．65±0．58)kg。在无菌条件下，将断奶仔猪屠宰并取其空肠待用。

1．3试验设计

1．3．1不同GLP-2添加水平对紧密连接蛋白相关基因表达的影响试验1采用单因子设计，设3个处理，每个处理9个重复，每个重复1孔，每个重复2个肠组织块。GLP-2的添加水平参考蒋荣川等［10］的结果，详见表1。

1．4试验方法

1．4．1肠组织块的制备将选取的28日龄断奶仔猪饥饿处理12h后颈静脉放血致死，迅速打开腹腔，无菌条件下取出空肠，并将空肠前段约20cm剪成10cm左右的肠段，用含200U/mL青霉素、200μg/mL链霉素的磷酸缓冲盐溶液(PBS)漂洗后，将肠段切割成5mm×5mm大小的组织块，并将来源于不同断奶仔猪个体的肠组织块混合，随机分配到各处理，然后置于含100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和10%胎牛血清的无菌DMEM培养液中进行培养。

1．4．2培养、取样及样品处理取各处理培养液1．5mL加入24孔培养板中，置于37℃恒温培养箱中预热30min，然后将肠组织块随机分配到培养液中，将培养板放在CO2培养箱(37℃、5%CO2)中培养72h，每24h换培养液1次。培养结束后，将组织放入液氮中保存12h，然后取出并置于－70℃条件下保存待测。

1．4．3肠上皮紧密连接蛋白相关基因以及信号激酶MEK1/2、p90RSK的基因mRNA表达量的测定

1．4．3．1RNA的提取空肠组织总RNA提取按照Trizol试剂(TaKaRa，日本)说明书进行，提取的总RNA最后溶解于无RNA酶水(RNaseFreedH2O，TaKaRa，日本)并在核酸蛋白质检测仪(BeckmanDu－800，CA，美国)上于260nm波长下测定RNA的浓度和纯度。

1．4．3．2目的基因cDNA的合成和实时荧光定量PCRcDNA合成采用逆转录试剂盒(PrimeScriptTMreagentkit，TaKaRa，日本)，反应体系为10μL:2μL5×PrimeScriptTMBuffer，0．5μLPrimeScriptTMEnzymeMix，0．5μLOligodTPrimer，0．5μLRandom6mers，4．5μLRNaseFreedH2O，2μLTotalRNA。反转录反应参数:37℃15min;85℃5s。反应结束后－20℃保存备用。实时定量荧光PCR法测定紧密连接蛋白相关基因ZO-1、Occludin、Claudin-1以及信号激酶基因MEK1/2和p90RSKmRNA表达量。测定仪器为CFX-96real-timePCRsystem(Bio-Rad，美国)，荧光染料为SYBRGreenⅠ(TaKaRa，日本)。反应体系为10μL:5μLSYBRPremixExTaqTMⅡ(2×)，1μL上游引物，1μL下游引物，2μLdH2O，1μLcDNA模板。利用NCBI搜索目的基因片段，运用Primer5、Oligo6．0软件进行引物设计，送交美国Invitrogen公司合成，引物序列见表3。反应程序为:95℃60s，95℃5s，退火温度(表3)下30s，72℃30s，40个循环。实时荧光定量PCR方法参考文献［12］，采用双Ct+标准曲线扩增效率校正法，标准曲线采用10倍梯度稀释法制作，每个样品3个重复，内参基因为β－肌动蛋白(β-actin)。1．5统计分析基因表达结果采用相对表达量的形式，以β-actin为内参基因，采用Pfaffl［11］的方法计算。采用SPSS13．0统计软件对数据进行统计分析，对平均值进行方差分析，作差异显著性检验，以P＜0．05为差异显著标准。

2结果

2．1不同GLP-2添加水平对断奶仔猪空肠上皮MEK1/2、p90RSK以及ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA相对表达量的影响由表4可知，添加1×10－8、1×10－7mol/L的GLP-2能显著促进断奶仔猪肠空肠上皮MAPK信号通路激酶基因MEK1/2、p90RSKmRNA表达，其中MEK1的mRNA的相对表达量分别比对照组(未添加GLP-2)增加了85．0%和301．0%(P＜0．05);MEK2mRNA的相对表达量分别比对照组增加了195．0%和747．0%(P＜0．05);p90RSKmRNA的相对表达量分别比对照组增加了47．0%和883．0%(P＜0．05)。伴随着MEK1/2、p90RSKmRNA表达的增加，紧密连接ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表达也随之增加。在含有1×10－8、1×10－7mol/LGLP-2的培养液中离体培养72h，ZO-1mRNA的相对表达量分别比对照组增加了29．0%和59．0%(P＜0．05);Claudin-1mRNA的相对表达量分别增加了120．0%和251．0%(P＜0．05);OccludinmRNA的相对表达量分别增加了54．0%和142．0%(P＜0．05)。除了ZO-1外，其他各基因的mRNA表达均随着GLP-2浓度的升高而增强(P＜0．05)。2．2向培养液中添加MEK1/2蛋白活性抑制剂后对断奶仔猪空肠上皮MEK1/2、p90RSK以及ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA相对表达量的影响向含有1×10－7mol/LGLP-2的培养液中添加10μmol/L的U0126，并将空肠组织块培养72h，与GLP-2添加组(1×10－7mol/L)相比，MAPK信号通路关键激酶基因MEK1/2、p90RSKmRNA相对表达量均显著降低(P＜0．05)，见表5。伴随着U0126的添加使MEK1/2、p90RSKmRNA的相对表达量显著降低，空肠紧密连接蛋白基因ZO-1、Occludin和Claudin-1mRNA的相对表达量也出现显著下降(P＜0．05)。与添加GLP-2组相比，添加GLP-2+U0126组ZO-1mRNA的相对表达量下降21．1%(P＜0．05)，OccludinmR-NA的相对表达量下降61．3%(P＜0．05)，Clau-din-1mRNA的相对表达量下降41．6%(P＜0．05)。

3讨论

3．1GLP-2对断奶仔猪肠上皮ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表达的影响已知ZOs、Occludin、Claudins蛋白作为紧密连接重要的结构蛋白，在紧密连接的组成和功能发挥中起着重要的作用，是构成肠道黏膜屏障，决定肠道通透性的重要蛋白质分子。其中，Occludin作为维持和调节紧密连接屏障功能的重要蛋白质，其进入紧密连接将使与其连接的膜通透性降低，仅允许小分子出入，而大分子难以进出［12］。它的存在和数量决定肠道选择性屏障，对其mRNA和蛋白质水平的检测可在一定程度上反映肠道紧密连接状况及屏障的被破坏情况［13］。Claudins是继Occludin之后发现的又一类参与紧密连接的四次跨膜蛋白，是构成紧密连接线的主要成分，在调节细胞连接和黏附中发挥着重要作用［14］。ZOs是一种外周膜蛋白，其特有的结构能与胞质内的Occlu-din蛋白的C末端连接，而ZO-1的末端则可结合肌动蛋白和应激纤维，从而将Occludin和肌动蛋白骨架系统连接在一起构成稳定的连接系统［15］。作为紧密连接的重要组成蛋白，考察ZO-1、Clau-dins和Claudin-1的表达变化是间接考察与肠道通透性变化的重要指标和方法［16］。由于断奶仔猪处于多重应激(如断奶、营养、转群等)之下，并受到大量传染病害的影响，容易使肠上皮紧密连接拆卸以及紧密连接蛋白表达降低［17］，进而导致肠道通透性增强，仔猪发生腹泻。而仔猪腹泻导致仔猪成活率低、生长缓慢和抵抗力低下，并容易感染其他疾病。大量的研究已经表明，向动物注射GLP-2能够显著地降低动物肠道的通透性，增强肠道的屏障功能，并促进动物的肠道健康［5－7］。但GLP-2影响肠道通透性和增强肠道屏障功能的机制目前尚不清楚。Zhang等［18］研究发现，通过营养手段提高肠道紧密连接蛋白基因ZO-1和OccludinmRNA及其蛋白质的表达，能够降低断奶仔猪肠道通透性、增强肠道屏障功能。陈振勇等［8］发现GLP-2能够促进大鼠肠道紧密连接蛋白基因ZO-1、Occludin、Claudin-1的表达。但由于啮齿类动物GLP-2的受体分布［19］与仔猪肠道GLP-2的受体分布［20］存在差异，其发挥效应的作用方式及细胞信号转导途径可能也存在差异。GLP-2能否通过促进断奶仔猪肠上皮紧密连接蛋白基因ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表达实现对肠道屏障功能的调节，一直缺少相关的报道。本试验结果表明，GLP-2促进了肠道紧密连接蛋白相关基因ZO-1、Occludin、Claudin-1的表达，这也可以作为解释Cameron等［5］、关莉莉等［6］和Benjamin等［7］研究中GLP-2降低肠道通透性、提高肠道屏障功能的原因。不仅如此，添加GLP-2还促进了MEK1/2、p90RSKmRNA表达的增加，这与Burrin等［21］和Jasleen等［22］在细胞研究中的结果相一致。这个结果提示我们，GLP-2不仅调节了肠道紧密连接蛋白基因的表达，而且其细胞信号调节通路与经典的MAPK途径紧密相关。

3．2GLP-2促进断奶仔猪肠道紧密连接蛋白相关基因表达的可能机制在以离体细胞培养试验中发现，GLP-2能够促进MAPK信号通路的关键激酶MEK1/2的活化和表达［23－24］。Burrin等［21］发现，向新生仔猪小肠细胞中添加一定水平的GLP-2，不仅显著促进了肠细胞的增殖、抑制了其凋亡，还显著促进了MEK1/2及其下游靶蛋白p90RSK的活化和表达，这表明GLP-2可能通过经典MAPK细胞信号转导通路实现对肠道细胞增殖及凋亡的调节。研究发现，胞外信号通过促进MEK1/2的活化和表达，能够达到促进或抑制紧密连接蛋白表达的目的［10］，MAPK信号通路作为一条重要的细胞信号转导通路在调控紧密连接中发挥着重要作用。那么，在以离体肠组织块培养条件下，GLP-2能否通过经典MAPK细胞信号转导通路促进肠上皮紧密连接蛋白相关基因表达，目前还没有相关报道。U0126是MEK1/2的特异性阻断剂［25］，它能通透细胞，选择性抑制MEK1/2，从而抑制MEK1/2的磷酸化和活化，使活化的激活蛋白1(AP-1)依赖的基因表达下降。在本试验中，添加U0126后使MEK1/2以及其下游p90RSKmRNA表达显著下降，这与郭晓等［26］的研究结果一致，表明从mRNA水平上，可以判断U0126抑制了MEK1/2的表达，阻断(或下调)了MAPK的细胞信号转导的强度。在本试验中，以离体的断奶仔猪肠组织块为模型，添加不同水平的GLP-2培养72h，不仅促进了MEK1/2mRNA的表达，同时也促进了ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA的表达，这说明GLP-2促进紧密连接蛋白相关基因的表达可能是通过促进MEK1/2mRNA的表达实现的。而添加MEK1/2的特异性阻断剂U0126后，ZO-1、Occlu-din和Claudin-1mRNA的表达量伴随着MEK1/2mRNA的大幅度下降而降低，这也表明MEK1/2的表达在GLP-2调控紧密连接蛋白相关基因的表达中发挥着重要作用，这2个方面的试验结果充分说明了GLP-2可以通过MAPK经典信号通路实现对紧密连接蛋白相关基因表达的调控。但是由于U0126并不能完全阻断ZO-1、Occludin、Clau-din-1的表达，由此可以推测，GLP-2促进断奶仔猪肠上皮紧密连接蛋白基因表达可能尚有其他的细胞信号转导通路，如cAMP依赖的蛋白激酶途径、酪氨酸激酶途径、三磷酸肌醇(IP3)途径和环磷酸鸟苷(cGMP)途径等信号转导通路，其具体的作用机制有待于我们进一步研究。

4结论

①添加1×10－8和1×10－7mol/L的GLP-2，离体培养72h能够显著地促进断奶仔猪空肠上皮MEK1/2、p90RSKmRNA表达，以及紧密连接蛋白相关基因ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表达。②向GLP-2培养液中添加MEK1/2的阻断剂U0126后，紧密连接蛋白相关基因ZO-1、Occlu-din、Claudin-1mRNA表达随着MEK1/2、p90RSKmRNA表达的下降而降低。③综合以上2个试验结果，GLP-2可能通过经典的MAPK信号转导通路促进了断奶仔猪肠道紧密连接蛋白相关基因的表达。