铝对大鼠海马［Ca2+］i和PKC生物活性影响

作者：邢伟，文涛，王彪，唐秋实，许金华，赵岩，张玉霞

【摘要】 目的 通过观察不同浓度慢性铝暴露对海马长时程增强（long?termpotentiation，LTP）的影响，检测海马细胞内Ca2+浓度和蛋白激酶C（PKC）生物活性，研究慢性铝暴露损伤学习记忆的机制。方法 选择断乳后Wistar大鼠，以含有不同浓度AlCl3的蒸馏水进行饲养。3个月后，测定脑铝、血铝、海马细胞内Ca2+，测量记录大鼠海马LTP，用改良的Takai法测定PKC活性的变化。结果 （1）各染铝组的［Ca2+］i与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01），但各染铝组间差异无统计学意义。（2）各染铝组PKC活性与对照组比较均降低，差异有统计学意义（P<0.01）。结论 慢性铝暴露引起大鼠海马细胞内［Ca2+］i下降，使PKC活性降低，导致下游分子的活性受到影响，破坏LTP的形成，损害学习记忆功能。

【关键词】 铝

海马长时程增强（LTP）是高频刺激 (HFS) 传入纤维引起的海马突触传递效能的长时间持续性增强,是在突触水平研究学习和记忆功能的模型。铝能损害动物的学习记忆功能，长期接触铝的人或慢性铝暴露动物的学习记忆能力出现不同程度下降〔1〕。急性给铝动物的LTP也明显受到抑制。铝对学习记忆的损害与改变细胞内的钙稳态、降低蛋白激酶C（PKC）的活性有关，与改变学习记忆相关的某些神经递质如谷氨酸、γ?氨基丁酸、乙酰胆碱等因素有关。本文通过慢性铝暴露观察大鼠海马Ca2+和PKC生物活性的影响，了解铝暴露损害学习记忆功能的作用机制。

1 材料与方法

1?1 材料与试剂 Wistar大鼠（中国医科大学动物室）；高速离心机（美国LKB公司）；液闪仪（德国BECK?MAN公司）；鱼精蛋白（美国Sigma公司）；［γ?32P］?ATP（北京福瑞公司）；其他试剂均为分析纯。

1?2 染铝动物模型 选择断乳后Witar大鼠体重30g，随机分为4组，每组10只。对照组喂水，染铝组分别喂含0.2％，0.4％，0.6％氯化铝的水。饲养3个月后，给予高频刺激。

1?3 测量并记录LTP 方法见文献〔2〕。观察完毕后，取出大鼠海马测其Ca2+浓度、PKC活性及Ng的蛋白表达。

1?4 海马细胞的分离及细胞内Ca2+浓度的测定 方法见文献〔3〕。

1?5 胞膜提取和PKC活性测定 方法见文献〔4〕。

2 结果

2?1 鼠血铝和脑铝的浓度（表1） 用原子吸收石墨炉法测定。染毒组随铝浓度的增加，血铝和脑铝浓度随之增加。染铝组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；0.2%与0.4%染铝组比较，差异有统计学意义（P<0.01）；0.4%与0.6%染毒组比较，差异无统计学意义。

表1 各组大鼠血铝和脑铝的比较（略）

注：与对照组比较，a P<0.01；与0.2%染铝组比较，b P<0.01

2?2 鼠脑海马CAI区结果 HFS后染铝组大部分鼠脑海马CAI区LTP增强幅度下降，染铝组大部分大鼠海马CAI区LTP增强幅度与对照组比较均有下降。染铝各组高频刺激后LTP增加的群体峰电位（PS）幅值比率（0.2％组；0.4％组；0.6％组）与对照组相比均明显降低，随着染铝剂量的增加，LTP增加的PS幅值比率逐渐下降；在对照组中高频刺激后PS幅值稳定且增长平均在150%左右，符合正常的生理现象，而染铝组高频刺激后PS幅值基本与初始相同，在45min以后其PS幅值仍然没有上升到正常的生理范围，表明染铝抑制了大鼠LTP的发生和维持；此外在染铝组均出现了有长时程抑制（LTD）的现象，而对照组却未出现。

2?3 不同浓度的铝对大鼠海马［Ca2+］i的影响 对照组细胞内钙离子浓度为(308.65±84.41)nmol/L；染铝组细胞内钙离子浓度随着不同浓度的铝暴露，染铝组的钙离子浓度变化有所不同，0.2%，0.4%，0.6%分别为(228.38±51.74)，(185.87±42.15)，(195.43±36.95)nmol/L。染铝组钙离子浓度比对照组降低，差异有统计学意义（P<0.01）。

2?4 不同浓度铝对大鼠海马PKC活性的影响 对照组胞膜PKC活性(pmol/mg/min)为：13.38±4.15；染铝组胞膜PKC活性(pmol/mg/min)随着不同浓度的铝暴露，染铝组的PKC活性有所不同，0.2%，0.4%，0.6%分别为(9.84±3.84)，(8.35±2.32)，(7.56±2.06)。各染铝组细胞膜PKC活性比对照组降低，差异有统计学意义(P<0.01)，随铝浓度的增加，染铝组PKC活性也降低，但染铝组间差异无统计学意义。

3 讨论

突触传递、递质释放、酶的活力和学习记忆的形成等均与Ca2+密切相关。目前普遍认为LTP与记忆形成有关。而［Ca2+］i的增加在LTP的形成中起重要作用。该类［Ca2+］i的增加与NMDAR敏感的受体通道复合体有关,也与电压依赖性钙通道的开放引起细胞外钙内流及细胞内钙储库的钙释放有关。Moraes研究发现，Al3+在Ca2+快速内流期竞争性地抑制电位依赖性钙通道，当Al3+浓度为50μmol/L时就可抑制Ca2+内流，1mmol/L时则完全抑制Ca2+内流。Julka发现铝呈可逆性的剂量依赖方式阻断电压依赖型钙通道，阻止Ca2+流入突触。认为铝的结合位点在通道内部，一旦铝与通道结合，该结合位点便不易易位，并使通道随电压改变而启闭的功能消失。本实验结果表明，由于不同浓度的铝暴露，各染铝组大鼠海马神经元［Ca2+］i比对照组明显降低,说明低浓度铝可干扰［Ca2+］i平衡机制,使海马神经元［Ca2+］i不同程度降低。研究表明,钙通道是铝作用的一个靶点〔5〕，细胞外的Al3+可经钙通道进入细胞，导致［Ca2+］i降低，破坏细胞内外钙稳态的平衡，从而影响LTP的发生和维持，造成学习、记忆的障碍。PKC的激活是产生和维持LTP的重要条件。PKC分为胞浆PKC和胞膜PKC两部分，生理条件下胞浆PKC没有活性，当受到外界刺激后，细胞内［Ca2+］i浓度升高使胞浆PKC转位到胞膜并与膜上第二信使二脂酰甘油（Diacylgcerol，DAG）结合而激活。PKC一方面可被钙离子激活，诱导LTP的生成；另一方面还可自身磷酸化，维持LTP的作用。现已证明，极低浓度铝即可取代这一反应中的Ca2+，而PKC对铝取代钙的作用非常敏感〔6〕。Cochran等人用离体脑片研究发现，当Al3+浓度为2×10-3mol/L时可抑制大鼠脑组织PKC活性达90%〔7〕。本实验结果也表明，随着摄铝的增加，胞膜PKC的活性逐渐下降，而胞浆PKC的活性却无明显变化，其原因可能是因为铝抑制了Ca2+依赖性谷氨酸盐释放，降低突触后膜对递质的敏感性；同时还抑制Ca2+经电压依赖性通道进一步内流，从而使细胞内钙离子浓度降低，胞浆PKC无法正常向胞膜转位与DAG结合而被激活。由于PKC活性降低影响LTP的正常诱导和维持，从而造成学习和记忆障碍。

【参考文献】

〔1〕 胡剑峰，晏云霞，肖鸿美,等.铝对学习记忆的影响及其可能的机制［J］.中国临床康复，2005，9（5）：140-142.

〔2〕 杨菁，孙黎光，宗志宏，等.慢性染铅对海马CA1区LTP及ERK2活性影响［J］.中国公共卫生，2004，20（1）：21.

〔3〕 D ildy J,L eslie S.Ethanal inhibits NMDA?induced increases in free intracellular Ca2+ in dissociated brain cell［J］.Brain Res,1989,499(1):383-387.

〔4〕 邢伟，孙黎光，时利得，等.染铅鼠脑海马PKC活性与LTP的相关性研究［J］.卫生毒理学杂志，1996，22（10）：155-156.

〔5〕 Busselberg D,Platt B,Michael D,et al.Mammalian voltage-activated calcium channel currents are blocked by Pb2+,Zn2+,Al3+［J］.J Neurophysiology，1994，71(4):1491-1497.

〔6〕 李欢欢，林文娟.神经颗粒素与脑老化、疾病及应激关系［J］.心理科学进展，2004，12（1）：126-132.

〔7〕 Cochran M,Elliontt DC,Brennen P,et al.Inhibition of protein kinase C activation by low concentrations of aluminum［J］.Clin Chem Acta，1990，12，24.194(2-3)：167-172.