HIF―1α与VEGF在稽留流产组织中的表达及意义

[摘要] 目的 探讨HIF-1α与VEGF在稽留流产及正常早期妊娠绒毛组织中的表达及意义。 方法 选择早期妊娠（对照组）及稽留流产（实验组）患者各50例，用免疫组化SABC法分别检测两组患者绒毛组织中HIF-1α与VEGF的表达情况。 结果 HIF-1α在对照组中表达阳性率为42%，在实验组表达阳性率为76%，差异有统计学意义（P

[关键词] 稽留流产；HIF-1α；VEGF

[中图分类号] R714.43 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）35-0127-03

稽留流产是一种特殊类型的自然流产，指宫内胚胎或胎儿死亡未及时排出者，早期者也称胚胎停育。自然流产的发病率约为10%～15%。稽留流产的确切发病率不清楚，有报道称约为流产人数的1%，且有逐年增高趋势[1]。稽留流产的具体病因不明，常见的病因如染色体异常、激素水平异常、内膜容受性低、解剖结构异常、环境污染及特发性稽留流产等。这些病因导致胚胎停止发育的具体机制尚未阐明，目前也没有系统的相关学说。我们周围的空气中氧浓度约为21%，而大多数成人器官内氧浓度仅2%～9%（生理性低氧），正常早期胚胎发育也是在低氧环境中完成的[2]。稽留流产的发生是否与胚胎不能适应低氧环境相关，目前国内外研究少有涉及。缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1-alpha，HIF-1α）是主要的氧浓度调节因子，血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是强有力的血管生成因子，两者均在许多生理及病理状态中起作用。本研究通过检测正常早期妊娠及稽留流产患者绒毛组织中HIF-1α和VEGF的表达，探讨稽留流产患者绒毛组织中HIF-1α、VEGF的表达情况及其与稽留流产发生的关系，为稽留流产的发病机制研究提供新的思路。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择稽留流产患者50例为实验组，早孕自愿要求终止妊娠患者50例作为对照组。实验组患者年龄18～30 岁，平均 23.6岁，月经周期规律，停经45～60 d，平均50.6 d，经临床妇科检查、血β-HCG、孕酮和B超检查证实为宫内妊娠且胚胎停止发育；对照组患者年龄19～33 岁，平均24.5岁，月经周期规律，停经42～57 d，平均48.1 d，自愿要求终止妊娠，B超提示宫内妊娠，见心管搏动。两组患者的年龄、孕产次、停经天数比较差异均无统计学意义。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 终止妊娠均采用吸宫术。术前行白带常规、血常规、心电图及妇科检查均无明显异常。在负压下（负压400～500 mmHg）行吸宫术采集绒毛组织，并将绒毛组织用生理盐水漂洗干净后置于10%中尔马林溶液中固定，石蜡包埋，连续切片（厚5 μm），行免疫组化检测。

1.2.2 免疫组化检测 切片经二甲苯、梯度酒精脱蜡至水，免疫组化采用SABC法，严格按试剂盒（武汉博士德公司）说明书进行，0.3%H2O2甲醇室温孵育30 min，0.1M PBS冲洗5 min×3次，枸橼酸钠修复液微波抗原修复，PBS冲洗，5%正常羊血清37℃孵育30 min，倾去血清，分别滴加一抗HIF-1α与VEGF（武汉博士德公司，1：100），4℃冰箱过夜，PBS冲洗，分别滴加生物素化二抗（1：100）50 μL，37℃孵育30 min，PBS冲洗，滴加SA/HRP（1：100）50 μL，37℃孵育30 min，PBS冲洗，新鲜配制的DAB显色5 min，清水冲洗，苏木素复染，常规脱水、透明、中性树胶封片。以PBS代替一抗作阴性对照，以已知阳性切片作为阳性对照。

1.2.3 结果判定 ①HIF-1α和VEGF在绒毛组织中的表达 HIF-1α主要表达于滋养细胞和合体滋养细胞的胞浆和间质，少量表达于胞核。VEGF主要表达于滋养细胞和合体滋养细胞的胞浆和间质，在胞核中无明显表达。两者阳性细胞表达均于镜下出现淡棕黄色、棕黄色、棕褐色颗粒。②结果判定[3] 综合显微镜下阳性细胞染色程度及阳性细胞百分比来判断。每张切片随机取5个400倍高倍镜视野，进行染色强度计分和阳性细胞百分比计分。无明显细胞着色为0分，着色呈淡棕黄色为1分，棕黄色2分，棕褐色3分；阳性细胞数无、≤25%、26%～50%、51%～75%、>75%分别计0、1、2、3、4分。上述两种计分结果相加，0～1分为阴性（-），2～3 分为弱阳性（+），4～5 分为阳性（++），6～7分为强阳性（+++）。

1.3 统计学方法

使用SPSS12.0软件进行数据统计。计数资料比较采用χ2检验。HIF-1α与VEGF在实验组和对照组中的相关性采用直线相关Pearson相关系数分析。以α=0.05为检验水准，P

2 结果

2.1 HIF-1α在两组患者绒毛组织中的表达

见表1。HIF-1α在对照组中表达阴性者29例，表达阳性者21例，阳性率42%；实验组表达阴性者12例，表达阳性者38例，表达阳性率76%。HIF-1α在实验组中表达阳性率高于对照组中阳性率（χ2=5.974，P

2.2 VEGF在两组患者绒毛组织中的表达

见表1。VEGF在对照组中表达阳性率为100%；在实验组表达阴性者17例，表达阳性者33例，表达阳性率为66%。VEGF在实验组中表达阳性率低于对照组中阳性率（χ2=9.647，P

2.3 HIF-1α和VEGF在两组患者绒毛组织中表达的差异

见图1。HIF-1α在实验组中的表达高于对照组中的表达，差异有统计学意义（χ2=5.974，P

3 讨论

胚胎发育早期需要适应宫腔内相对低氧的环境。成功的妊娠依赖滋养细胞正确的胎儿胎盘血管生成，正确的血管生成才能为胚胎提供氧气和营养物质[4]，使其适应低氧环境。若着床后绒毛血管生成不足，不能形成健康的血管网络，则胚胎将不能如期发育而致妊娠丢失[5]。

血管内皮细胞生长因子（VEGF）是一种由血管内皮细胞、滋养细胞和炎性巨噬细胞等分泌且作用于血管内皮细胞促进其有丝分裂的细胞因子，被认为是最强有力的血管生成因子。VEGF不仅能刺激血管生成，还能增加血管通透性及抗细胞凋亡[6]。早期妊娠时，伴随着胚胎的着床与植入、胚胎与子宫内膜之间血管的建立，VEGF大量产生[7]，在自然流产患者绒毛组织中VEGF表达则明显下降[8]。本研究显示，在正常妊娠绒毛组织（对照组）中，VEGF表达率100%，而在稽留流产组织中表达率仅66%，有明显差异，与胡瑞华[9]等研究结果一致，说明VEGF正常表达是正常妊娠必不可少的条件之一，而其表达下降将导致妊娠失败。缺氧诱导因子1α（HIF-1α）是1992 年由Semenza等找到的一种氧依赖转录激活因子，其表达受多个途径诱导，对氧浓度极为敏感，是氧感受家族中的管家转录因子，是缺氧应答的全局性调控因子，为主要的氧浓度平衡调节因子[10]。低氧条件下，HIF-1α降解受抑制，能迅速合成和累积，从而调节其靶基因的转录[11]，在正常早期妊娠维持中起重要作用。HIF-1α促进血管生成的下游靶基因及作用机制尚未完全明确。在成人造血干细胞中，发现HIF-1α的两大靶基因之一为VEGF。有研究者对血管内皮前体细胞中HIF-1α基因敲除的小鼠胚胎研究发现，基因敲除后血管前体细胞明显减少，胚胎中血管生成明显减少[12]。Yan Fang等研究表明[13]，正常早期妊娠人流绒毛组织中，HIF-1α表达增加，并通过Dll4/Notch信号转导系统增加VEGF表达；稽留流产绒毛组织中HIF-1α表达进一步增高，但Dll4/Notch表达与HIF-1a-VEGF表达关系失衡，VEGF表达减少，这种调控机制被破坏可能是稽留流产发生的原因。HIF-1α在缺氧环境中的另一个作用是造成细胞凋亡[14，15]。RL95-2细胞系是研究子宫内膜容受性的良好载体，Xu BF等[14]曾对RL95-2细胞系在低氧条件下进行培养研究，发现随着培养时间延长，细胞凋亡率逐渐增加，HIF-1α表达率也逐渐增加，推测HIF-1α有致细胞凋亡作用而降低子宫内膜容受性。本研究中，正常妊娠绒毛组织中HIF-1α表达率42%，而在稽留流产绒毛组织中表达率升高为76%，差异明显；且对照组中，HIF-1α和VEGF表达呈正相关，说明增高的HIF-1α上调VEGF表达，而实验组中HIF-1α和VEGF无明显相关关系，说明稽留流产组织中HIF-1α表达虽进一步增加，但未能上调VEGF的表达。推测可能在稽留流产组织中，缺氧更为严重，HIF-1α表达增加更明显，但因信号转导系统被破坏，HIF-1α表达虽进一步增加，并未能引起VEGF表达相应增加，反而增加了细胞凋亡，导致稽留流产发生[15]。

总之，健康的血管网络的形成是成功妊娠的重要条件。而稽留流产绒毛组织中HIF-1α虽表达增加，但VEGF合成仍减少，血管网络不能如期形成导致妊娠失败。尚需要更多的研究来进一步揭示稽留流产发生的机制。

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（收稿日期：2014-10-28）