瞬态荧光光谱仪在核壳纳米体系中能量传递过程中的应用经验

摘 要：本文构建了一种以核壳纳米颗粒为模型的体系，研究在荧光团激发后的能量传递过程。其中，以15nm大小的金纳米颗粒作为核，在金纳米核周围包裹一层13nm厚度的二氧化硅壳层作为间隔，在壳层外侧以共价键的形式修饰一层FITC染料分子，利用瞬态荧光光谱仪清晰地判断出了其中的辐射跃迁以及非辐射跃迁速率，从实验结果看出，染料分子发生能量传递之后，其辐射跃迁速率升高，非辐射跃迁速率降低。

关键词：瞬态荧光光谱；能量传递；辐射跃迁速率；非辐射跃迁速率

分子吸收能量使得基态的电子被激发到单线激发态，并由第一单线激发态回到基态时发出的光就是荧光。荧光寿命是指分子在单线激发态所平均停留的时间，即激发态的电子回到基态所用时间，这个速率一般为108s-1，因此一个典型的荧光寿命大致为10ns。由于荧光寿命所处的时间范围是一个非常短的时间，因此检测荧光寿命需要非常精密准确的光电仪器，通常所用的荧光寿命的仪器为瞬态荧光光谱。荧光团的荧光寿命不但与其自身的结构关系密切而且与其所处微环境的极性、粘度等条件有关，研究体系所发生的变化，都可以通过荧光寿命测定得到直观的了解。例如，分子之间发生的团簇、荧光团与荧光受体之间发生共振能量传递、两个分子或者荧光团由于光诱导下发生的电荷传递导致荧光的猝灭以及蛋白质结构大重排异构等现象都能通过荧光寿命的表征“看”出究竟[1]。

与稳态荧光光谱相比，瞬态荧光光谱有着其他一些无法比拟的优势[2]，例如，稳态荧光中，荧光的强度变化与物质的浓度有着绝对的依赖关系，一般的检测利用这一关系能够方便的对物质的性质，体系的变化过程有一个大致的认识，但是有时这种过于依赖浓度却容易成为测试过程中的误差及人为操作失误。与稳态荧光光谱法相比，荧光寿命的测量则与荧光体周围环境的散射和光学系统的调整无关，且不依赖于从荧光团到探测器的光学路径，因而，在很多情况下是一种更有效的检测方法[3]。例如，在研究荧光共振能量传递过程中的机理时，由于发生了能量传递，从稳态光谱中可以观测到荧光强度的猝灭或升高，依据这一现象可以解释供体及受体之间所发生的传递机理，但是稳态光谱中的荧光信号强度与浓度的关系密切，但是在实验操作的过程中有时由于实验的需要，对体系进行其它处理（例如，离心、稀释等）。这就导致观测到的荧光信号不是由于能量传递过程导致的而是因为一些操作误差所引起。而通过瞬态荧光光谱进行荧光寿命的测试就能很好的规避这些现象，因为，荧光寿命的变化只能由于发生了共振能量传递，使得供体受体荧光发射机理了变化。因此，在研究荧光发射机理等实验中，瞬态荧光光对于稳态荧光是一种很好地补充及佐证[4]。本文将重点介绍瞬态荧光光谱的测试手段、机理并且以德国PicoQuant公司的荧光光谱仪为例，介绍在科研工作中的实际操作及应用过程。

1.荧光寿命的测定

现代方法中荧光寿命的测定主要包括三种：时间相关单光子记数法（Time 2 Correlated Single 2Photon Counting ， TCSPC ）、相调制法（ Phase Modulation Methods） 和频闪技术（ Strobe Techniques）[3]

1.1相调制技术

相调制技术也称之为“频域法”（Frequency 2 Domain Method）。正弦调制的激发光激发样品后，发射光与激发光之间存在着一种受迫响应，因此发射光和激发光有着相同的圆频率（ω），但是由于荧光寿命的存在，电子在激发态会有一定的停留时间，调制发射波在相上滞后激发波一个相角。利用实验测定的相角和解调参数，可计算出相寿命（τp）和调制寿命（τm），对于单指数衰减，τp与τm相等。

1.2频闪技术

频闪技术也叫脉冲取样技术（Pulse Sampling Techniques），测定中，样品被脉冲光源激发。与脉冲光源同步，电压脉冲启动或按一定程式延迟启动光电倍增管，光电倍增管按预设时间门检测样品的荧光强度。一般检测时间门比荧光寿命短得多，这样通过逐渐改变光电倍增管的延迟时间，可以得到样品被脉冲光源激发后不同时刻的一系列荧光强度。

1.3时间相关单光子记数法

TCSPC是目前主要应用的荧光寿命测定技术，简单的说单光子计数法的工作原理是：光源发出两束相同的脉冲光，其中一束通过起始光电倍增管，使得光电倍增管产生一个电信号，该信号启动时辐转换器开始工作，另外一束脉冲光到达样品池后，激发样品，产生的荧光通过单色器等到达终止光电倍增管，终止光电倍增管产生的信号停止时幅转换器的工作，而这样的一个时间差被多道多道分析仪 （ Multichannel Analyzer）进行记录、累计，表明产生了一个该时间下的光子，经过几十万次重复以后 ，不同的时间通道累积下来的光子数目不同。将这些数目的光子对时间作图后得到的就是一个荧光衰减曲线[5]。TCSPC 法的突出优点在于灵敏度高、测定结果准确、系统误差小，是目前最流行的荧光寿命测定方法。本实验中所采用的测量手段就是TCSPC法[6]。

2.荧光寿命及其含义

假定一个无限窄的脉冲光（δ函数） 激发n0个荧光分子到其激发态，处于激发态的分子将通过辐射或非辐射跃迁返回基态。分别用kr和knr表示两种跃迁时的速率，那么激发态衰减速率可表示为：

dn（t）/dt=（kr+knr）n（t）

其中n（t）表示时间t时激发态分子的数目，由此可得到激发态物种的单指数衰减方程。kr为辐射跃迁衰减速率knr为非辐射跃迁衰减速率，由于发射是一个随机事件，受激后的荧光团在一定的时间内具有着相同的发射概率，由此可得到激发态物种的单指数衰减方程[7]：

n（t）=n0exp（-t/τ）

在实际的实验中虽然不能直接的观测到受激后的分子数目但是荧光强度与受激分子的数目n（t）成正比，因此可将上式改写为时间相关的荧光强度I（t）公式：

I（t）=I0exp（-t/τ）

其中I0为时间为0时的荧光强度，荧光寿命定义为衰减总速率的倒数：

τ=（kr+knr）-1

也就是说荧光强度衰减到初始强度的1/e时所需要的时间就是该荧光团在测定条件下的荧光寿命。实际上用荧光强度的对数对时间作图，直线斜率即为荧光寿命倒数的负值。荧光寿命也可以理解为荧光物种在激发态的统计平均停留时间。

3.实验部分

3.1试剂部分：

异硫氰酸荧光素（FITC）99%，上海精纯化学试剂有限公司；3-氨丙基三乙氧基硅烷（APS）98%，上海精纯化学试剂有限公司；正硅酸乙酯（TEOS）分析纯，上海光复发展有限公司；氯金酸99%，上海中秦化学试剂有限公司；无水乙醇，上海光复发展有限公司；氨水，上海光复发展有限公司。

3.2仪器介绍：

FluoTime200荧光寿命光谱仪配有Picoharp300时间相关单光子计数器，光源为4个LED脉冲光源，以光纤为传输介质，分别为282nm、376nm、464nm、497nm、另外，还配有一个激光光源[8]，波长为633nm-535nm。拟合软件为Fluofit

version4.5。

15nm金纳米颗粒的合成：将3.2mL氯金酸25mM母液溶于48mL的超纯水中，将溶液搅拌均匀后，加热到沸腾，迅速加入8mL事先预热好的38.8mM的柠檬酸三钠水溶液，剧烈搅拌，并且继续加热到沸腾，溶液的颜色有黑色变为酒红色后，开始计时，保持沸腾状态冷凝回流10min，关闭热源，自然冷却到室温，则可以得到粒径大小为15nm左右的金纳米颗粒[9]。

核壳纳米颗粒的合成：将预先制备好的金纳米颗粒水溶液60mL放入100mL圆底烧瓶中，加入0.5mL，12.8g/ mL平均分子量为10000g/mol的PVP水溶液，在室温下剧烈搅拌36h以上，使得PVP分子吸附在金纳米颗粒的表面，在11000rpm下离心30分钟，将上清液去除，沉淀部分用超纯水再分散为30mL的水溶液。然后取5mL该溶液，加入14.6mL乙醇以及0.4mL氨水，剧烈搅拌均匀，在恒压滴液漏斗中放置10mL，1.19mM的TEOS的乙醇溶液，逐滴的将TEOS乙醇溶液滴入金纳米颗粒溶液中，并且控制较慢的搅拌速度。6h内滴加完毕TEOS乙醇溶液，继续搅拌反应12h，直到金纳米颗粒外层长上10nm左右的二氧化硅壳层，形成金核二氧化硅壳的纳米体系[10-13]。

FITC分子负载在核壳纳米颗粒表面：为了将FITC分子以共价键的形式连接在二氧化硅外层形成金@二氧化硅@FITC的体系，首先，先对FITC分子进行修饰，然后将修饰后的FITC分子连接到二氧化硅壳层外，简单的说步骤为：将1 mg FITC分子以及2 μL APS分子溶解在50 mL的无水乙醇溶液中在氩气保护下，黑暗环境中反应48 h，使得APS分子上的氨基与FITC分子中的异硫氰根相连，形成APS-FITC体系，紧接着2.5 mLAPS-FITC分子以及1 μL TEOS分子一起加入到30 mL金@二氧化硅体系中，搅拌下反应24 h，反应完成后离心、洗涤将没有连接在二氧化硅壳层表面的FITC分子除去。

4.结果与讨论：

金核包裹二氧化硅壳层后的电镜照片如图1所示，中间较黑色的部分为金核，粒径大小大约为15nm，包裹二氧化硅的壳层为浅灰色部分，厚度大约13nm左右，最外层的FITC染料是小分子层，因此，在透射电镜照片中看不到。

由透射电镜照片可以证明本实验体系构建。在此体系的基础上，由于染料分子受激后的荧光发射光谱与15nm粒径的金纳米颗粒的紫外可见消光光谱的光谱重叠度较大，当在一个合适的距离时（大约20nm以内），受激后的染料分子与金纳米颗粒之间会发生荧光共振能量传递（FRET）过程，在这一过程中染料分子的荧光会大幅度的降低，同时染料分子的荧光寿命也会发生变化，且荧光寿命的变化相比于稳态荧光更加真实可靠。

荧光寿命的测试：选择464nm脉冲LED作为光源，首先，打开fluotime200荧光光谱仪，打开LED光源的电源控制器后，等待LED光源点燃1min后打开TCSPC控制器电源，在测试之前，将整个仪器预热30min以上后再使用。仪器预热完毕后，用2cm左右宽度的纸条，调节光源的位置以及光斑的大小，光源位置要处在样品槽的中下端，光斑大小为1cm左右的实心圆斑。测试之前，为了保护仪器的安全性，首先将IRIS以及LED光源电压关到最小。接着点开操作软件，将计算机与测试系统相连，等软件连接完毕后，初始化波长，使得波长处在最小值。在测试之前首先要大致的了解样品的信息，在本实验中，FITC是一种量子产率很高的荧光染料，荧光的最大发射在520nm，其荧光寿命大致在4 ns左右，因此，在测试时先将探测波长设置为520nm，然后设置一个合适的电压以及重复频率，重复频率的选择遵循这样一个公式：重复频率≤1/10*τ，本实验中FITC的荧光寿命为4ns，依据公式选择重复频率为25MHz或者更小的一个值，因此选择20MHz较为合理。通过设置电压的大小以及IRIS的调节将信号的强度控制在重复频率的5‰以内。

Fluotime200在收集信号时可以设置收集一定的光子数（counts）以及一定的收集时间，这就使得信号的采集具有两种模式：在无限时间内收集确定的光子数；在一定时间内收集一定的光子数。在本实验中为了测量辐射跃迁速率常数，我们采用后一种测试方式。测试结果如图2所示，红色以及绿色的点为原始数据，通过fluotit软件对数据进行拟合拟合后所得荧光寿命见表1。

图2 FITC参比以及13nm二氧化硅壳层包裹金核体系中的荧光寿命，黑色线为拟合结果，激发波长：464nm，探测波长：520nm

我们通过实验测得的荧光寿命可以分析出在染料分子FITC与金纳米颗粒之间发生共振能量传递之后的辐射跃迁以及非辐射跃迁速率的变化[14]：

其中 代表荧光团的荧光量子产率，FITC的量子产率为0.97，由此可得FITC的辐射跃迁速率常数kr，在公式2中的Ir（t=0）以及Ir0（t=0）分别为图2中两种体系在收到光激发后的光子数，然后通过公式1中所得的FITC的辐射跃迁速率常数kr0，可以计算出13nm二氧化硅壳层厚度核壳体系中的辐射跃迁速率常数kr，再通过公式3可以得出各个体系中的非辐射跃迁速率常数knr，所有计算结果以及拟合后的荧光寿命都列于表1中。

5.结论

总之，我们通过设计以金纳米颗粒作为能量传递过程中的受体，荧光分子FITC作为给体，将二者以共价键的形式相连，其中的距离我们通过一定厚度的二氧化硅壳层作为间距。在此体系中研究辐射跃迁及非辐射跃迁过程，利用Picoquant公司的瞬态荧光光谱仪Fluotime200对体系进行表征。在464nm波长脉冲LED作为光源激发下的体系，其共振能量传递中所导致的辐射跃迁速率与非辐射跃迁速率的变化都可以通过瞬态荧光光谱仪得到系统的表征和论证。

参考文献：

[1]阎吉祥，李家泽.激光诱导荧光寿命及其测量[J].光学技术，1997，（02）.

[2]Jin Y.Multifunctional Compact Hybrid Au Nanoshells： A New Generation of Nanoplasmonic Probes for Biosensing， Imaging， and Controlled Release[J]. Accounts of Chemical Research， 2013.

[3]王文韵，于皎路，于英宁，et al.分子和离子的荧光寿命测量和研究[J].激光杂志，1993，（03）.

[4]Mandal S， Ghatak C， Rao VG， et al.Pluronic Micellar Aggregates Loaded with Gold Nanoparticles （Au NPs） and Fluorescent Dyes： A Study of Controlled Nanometal Surface Energy Transfer[J]. The Journal of Physical Chemistry C， 2012， 116（9）： 5585-5597.

[5]程颖，任明明， S. A， et al. 基于TCSPC技术的心肌细胞NAD（P）H荧光光谱和寿命的研究.In：中国遗传学会第十届全国激光生物学学术会议论文摘要集，2009.

[6] 房喻， 王辉.荧光寿命测定的现代方法与应用[J]. 化学通报， 2001， （10）.

[7] Kim K-S， Kim J-H， Kim H， et al.Switching Off FRET in the Hybrid Assemblies of Diblock Copolymer Micelles， Quantum Dots， and Dyes by Plasmonic Nanoparticles[J]. ACS Nano， 2012， 6（6）： 5051-5059.

[8] 叶明树， 田治富， 胡庆， et al.脉冲LED激发罗丹明B瞬态荧光光谱特征[J]. 华侨大学学报（自然科学版）， 2011， （06）.

[9] Frens G.Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions[J]. Nature， 1973， 241（105）： 20-22.

[10] Liz-Marzán LM， Giersig M， Mulvaney P.Synthesis of nanosized gold-silica core-shell particles[J]. Langmuir， 1996， 12（18）： 4329-4335.

[11] Shanthil M， Thomas R， Swathi RS， et al.Ag@SiO2 Core–Shell Nanostructures： Distance-Dependent Plasmon Coupling and SERS Investigation[J]. The Journal of Physical Chemistry Letters， 2012， 1459-1464.

[12] Chen Y， Chen HR， Guo LM， et al.Hollow/Rattle-Type Mesoporous Nanostructures by a Structural Difference-Based Selective Etching Strategy[J]. ACS Nano， 2010， 4（1）： 529-539.

[13] Graf C， Vossen DLJ， Imhof A， et al.A general method to coat colloidal particles with silica[J]. Langmuir， 2003， 19（17）： 6693-6700.

[14]Reineck P， Gómez D， Ng SH， et al.Distance and Wavelength Dependent Quenching of Molecular Fluorescence by Au@SiO2 Core–Shell Nanoparticles[J]. ACS Nano， 2013.