浅论猪链球菌病的鉴定及中草药体外抑菌试验

摘要猪链球菌病是猪的一种常见传染病。采集了疑似猪链球菌感染致死猪的脾和肝样本,对猪链球菌病进行了病原分离、微生物学检查及中草药体外抑菌试验。结果表明,黄连醇提物的抗菌活性最强;仙鹤草、地锦草醇提物抗菌活性较强;金银花醇提物抗菌活性较弱。

关键词猪链球菌;分离鉴定;中草药;体外抑菌

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猪链球菌病是一种常见传染病,目前该病呈明显上升趋势[1]。猪链球菌病发病急、病程短、死亡率高,临床上以哺乳仔猪和刚断奶仔猪发病率、死亡率高,大猪发病率较少。大量使用抗生素进行治疗,往往会导致多重超强耐药菌株出现和抗生素残留。由于耐药性的产生,使许多抗生素在临床上失效,造成治疗失败,导致疾病的暴发流行及死亡和医疗费用的增加。鉴于此,从传统中草药中筛选出有效的抗链球菌药物符合食品安全和公共卫生安全的需要。

1材料与方法

1.1试验材料

病料为疑似猪链球菌感染致死的脾和肝样本。供试试剂:染色液、常规试剂,由青岛农业大学兽医微生物实验室自制;板蓝根、金银花、黄连、怀、地锦草、马齿苋、仙鹤草,均购于山东省医药药材公司。试验动物为健康小鼠,均为22 g左右,由青岛药品检验检疫局提供。

1.2试验方法

1.2.1细菌学检查。在无菌条件下取病死猪的肝和脾,用灭菌的接种环插入组织中,取少量组织或液体涂片,干燥、火焰固定后进行革兰氏染色后镜检[2]。

1.2.2生化及生长试验。将分离出的纯培养菌株接种在血清琼脂培养基上,37 ℃培养24 h后,取鲜血琼脂平板上发生溶血的典型菌落进行各种常规生化试验和鉴别生化试验:分别接种于葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、木糖、山梨醇、菊糖等培养基上观察是否产酸;将分离菌株分别接种在上述培养基中进行生长试验。

1.2.3动物致病性试验。健康小鼠10只,随机分为2组,每组5只,其中试验组用分离的24 h肉汤纯培养菌株腹腔注射5只小鼠,0.5 ml/只;另外一组注射无菌生理盐水作对照,0.5 ml/只。观察其死亡和发病情况,并对死亡小鼠进行细菌分离。

1.2.4中草药体外抑菌试验。醇提物的制备:将药材分别粉碎,称取各中药粉末10 g,以75%乙醇回流提取2次,每次1.5 h;合并提取液,挥干溶剂后即为中药醇提物。将醇提物用甲醇溶解,蒸馏水稀释至含生药1 g/ml,流通蒸汽灭菌30 min,置冰箱4 ℃保存。待测菌制备:将菌种接种于lb培养基上,37 ℃培养24 h复壮;再接种于lb培养基,37 ℃培养18 h(10个/ml),待用。采用试管2倍稀释法,按文献方法略加改进测定最小抑菌浓度(mic)。

2结果与分析

2.1细菌学检查

对病料进行涂片、染色镜检,可见革兰氏阳性球菌呈成对或短链状排列。血平板上有疑似菌落,较小,凸起,灰白色,较干燥,光滑,边缘整齐,周围有透明溶血环。挑取鲜血琼脂平板上的典型菌落,进行革兰氏染色、镜检。可见革兰氏阳性球菌有的单在,有的呈双球型,有的呈短链状排列。

2.2生化及生长试验

分离细菌在37 ℃下能生长,在10 ℃和45 ℃下均不能生长。分离菌生化试验结果见表1。

2.3动物试验

在接种后36～84 h试验组和对照组呈现不同的症状变化,其中试验组2只分别于接种48、72 h后死亡,另外3只表现为食欲减退、精神沉郁,颌下淋巴结肿胀;剖检革兰氏染色镜检,发现有大量单个、成对或呈4～6个的短链革兰氏阳性球菌。对照组未见异常现象。

2.4中草药体外抑菌试验

中草药提取物对猪链球菌的mic见表2。由表2可知,黄连醇提物的抗菌活性最强,仙鹤草、地锦草醇提物抗菌活性较强,金银花醇提物抗菌活性较弱,马齿苋、板蓝根、怀效果均不明显。

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3结论与讨论

综合临床诊断、分离菌株的形态染色特性、培养特性、生化特性及动物试验,确诊本次病原为猪链球菌[3-6]。中草药的成分复杂,其抗菌作用可能是单一成分,也可能是几种成分共同作用的结果。试验仅对7种中草药的醇提物进行了体外链球菌抑菌试验,其中黄连醇提物的抗菌活性最强,这些提取物往往是多种成分混合物,究竟哪种成分抑菌效果最好,还有待进一步研究。另外,这几种药物对猪链球菌的体内抑菌效果还有待进一步研究。

4参考文献

[1] 杨建江,韩文瑜,雷连成,等.猪链球菌耐药性的检测[j].