百灵安神片微生物限度检查方法验证

摘要：建立百灵安神片的微生物限度检查方法。方法按照《中国药典》2010版微生物限度检查方法进行验证试验。结论本品可采用培养基稀释法检查细菌数，采用常规法检查霉菌及酵母菌数，可操作性强。

关键词：百椹安神片；微生物限度检查；抑菌作用

百灵安神片主要含有制何首乌、酸枣仁（炒）、桑椹、灵芝、百合、知母、丹参、、茯苓、合欢花等多种成分。其中多味中药材含有抑菌成分，可抑制污染的微生物生长，这就给药品造成了安全隐患，因此为了更好而有效的保障该药品的质量，我们根据《中国药典》2010年版一部附录[1]的要求对百灵安神片进行了微生物限度检验方法验证，以期获得更具科学性和准确性的微生物限度检查方法，从而保证检验结果的准确性。

1 药物与试剂

1.1样品 百灵安神片（批号130901-1，130901-2，130901-3）石家庄以岭药业股份有限公司

1.2 培养基 营养琼脂培养基（批号：20120802）；改良马丁琼脂培养基（批号：121027）；玫瑰红钠琼脂培养基（批号：20121211）；胆盐乳糖培养基（批号：1204232）；营养肉汤培养基（批号：120913）；改良马丁培养基（批号：120216）；乳糖胆盐发酵培养基（批号：20120412）；曙红亚甲蓝琼脂培养基（批号：1301262）；4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（批号：120423）；乳糖发酵培养基（1206214）；pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液

来源：中国药品生物制品检定所

1.3菌种 金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]；枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]；大肠埃希菌[CMCC（B）44102]；白色念珠菌[CMCC（F）98001]；黑曲霉[CMCC（F）98003]；乙型副伤寒沙门菌[CMCC（B）50094]，以上培养基和菌种由中国药品生物制品检定所提供。

1.4仪器 生化培养箱：LRH-250F上海一恒仪器有限公司；生物安全柜：美国Frontline；菌落计数器：XK97-A 姜堰市新康医疗器械有限公司；超速离心机：LD4-1.8型 北京京立离心机有限公司。

2 菌液及供试品的制备

2.1菌悬液的制备 ①取经30～35℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门菌的营养肉汤培养物，10倍稀释至50～100cfu/ml，备用；②取经23～28℃培养24～48h的白色念珠菌液体培养物，10倍稀释成50～100cfu/ml，备用；③取经23～28℃培养5～7d的黑曲霉斜面培养物，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每lml含孢子数50～100cfu的孢子悬液，备用；

2.2供试品制备 称取样品10g，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml制成1：10的供试液

3细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证

取规定量1：10供试液和上述制备好的阳性对照菌液1ml置平皿中，加入营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，混合均匀，放置凝固后，置培养箱中培养。每株试验菌平行制备2个平皿，计数，计算回收率：

3.1平皿法 取1：10供试液1ml/皿

3.2培养基稀释法 取1：10供试液2ml，每1ml供试液等量分注5个平皿，每5个平皿为一组，倾注营养琼脂培养基，混匀，凝固后，倒置培养。另外取1ml供试液和白色念珠菌、黑曲霉阳性对照菌液1 ml注入平皿中，做2个平行样，倾注琼脂培养基，混匀，凝固后，倒置培养。见图1。

图1

3.3计算回收率 试验组：按上述三种方法取1：10供试液，分别污染50～100cfu/ml的试验菌株，立即倾注细菌和霉菌培养基，待凝固后，置规定温度培养3～5d观察结果：菌液组：测定所加的试验菌数；供试品对照组：测定供试品的本底菌数；稀释剂对照组：方法同试验组。

4结果与分析

见表1～表3。

由表1可知：五株试验菌适宜稀释度菌悬液菌落个数都在50～100cfu，因此符合微生限度检查方法验证用菌种稀释度要求。

5控制菌检查方法验证

见表4～表6。

从表4、表5、表6可以看出：该供试品控制菌检查可采用1：10供试液进行控制菌检查。

本品按照《中国药典》2010年版一部附录[1]检查，由以上试验结果得：按供试品制备方法称取10g，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml制成1：10的供试液，细菌限度检查采用培养基稀释法（0.2ml/皿），霉菌及酵母菌限度检查采用常规法；控制菌限度检查采用常规法。

6讨论

中药制剂含有多种成分，其中部分成分具有一定的抑菌作用，给中成药微生物含量检测带来一定困难。采用常规法进行微生物限度检查，将影响微生物限度检查结果的准确性，对患者安全用药埋下隐患。

通对本品的微生物限度检查计数方法的验证可知：建立了百灵安神片的微生物检查方法，可采用培养基稀释法（0.2ml/皿）进行细菌限度检查，可采用常规法进行霉菌及酵母菌限度检查；采用常规法进行控制菌限度检查。解决了药物抑菌成分的存在对微生物限度检查产生的干扰，能够真实、客观地反映药物的染菌情况，使检查结果科学、准确、可信。在处方、生产工艺及检测环境不变的情况下，可按上述验证后的方法进行本品的微生物限度检查。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录79-88.