芪蟾口服结肠靶向片初步药效学研究

摘要：目的：观察芪蟾口服结肠靶向片浸膏对小鼠的急性毒性反应，以评价其安全性；研究芪蟾口服结肠靶向浸膏对H22荷瘤小鼠的抗肿瘤作用。方法：采用经典的急性毒性试验方法测定芪蟾口服结肠靶向浸膏的半数致死量（LD50），观察急性毒性症状，记录死亡数；建立H22荷瘤小鼠模型，随机分成6组，分别给予芪蟾口服结肠靶向浸膏高、中、低剂量灌胃，临床汤剂组灌胃，化疗药物5―Fu腹腔注射单独应用，生理盐水灌胃。正常饲养，给药10天后，摘眼球取血，处死小鼠，分别取出肿瘤组织、小鼠脾脏、胸腺，进行抑瘤率、脾指数、胸腺指数的检测。采用酶联免疫法测定TNF-α、IFN-γ细胞因子水平。结果：芪蟾口服结肠靶向片浸膏小鼠口服LD50为43.26g・kg-1，相当于人临床日用量的19.6倍，；芪蟾口服结肠靶向浸膏各剂量组均可有效抑制肿瘤生长，5-Fu腹腔注射单独应用的抑瘤率为40.52%，芪蟾靶向浸膏3个剂量组的抑瘤率分别为37.41%、33.21%、31.85%。与5-Fu组比较，芪蟾口服结肠靶向浸膏各剂量组能显著提高小鼠脾脏、胸腺的重量（P＜0.05）。与模型对照组相比，能明显提高细胞因子TNF-α，IFN-γ的水平（P＜0.05）结论：芪蟾靶向浸膏各剂量组均可不同程度抑制肿瘤的生长，以芪蟾靶向浸膏低剂量组效果最为明显，其作用机制与增加小鼠免疫器官重量、增加细胞因子TNF-α，IFN-γ水平等有关。提示芪蟾靶向浸膏有抗肿瘤作用，为临床应用提供科学的实验数据，对临床有实际的指导意义。

关键词：芪蟾靶向片；急性毒性；小鼠H22移植瘤；TNF-α；IFN-γ

中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-7717(2012)03-0598-04

Study of Preliminary Pharmacodynamics on Qichan Targeted Slices

TIAN Gang，HUANG Yuye，YU Yue，SONG Xiaohong

(Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053,Zhejiang,China)

Abstract:Objective：To observe the acute toxicity test of Qichan targeted slices and to provide experimental data for safe use in clinical. To study antitumor activity of Qichan targeted slices on carcinomas.Methods: The extract of Qichan targeted slices was administrated to mice. The LD50 was tested by the classical methods of acute toxicity. The acute toxic symptoms was observed, the accumulated death number were recorded. The model of hepatocarcinoma 22 solid tumor-bearing mice produced with Balb/c mice passage in intraperitoneal were randomly divided into 6 groups and treated with the extract of Qichan targeted slices (low-dose，meta-dose，high-dose)， 5-Fu respectivel use along and NS. After giving drugs for 10 days, the mice were killed, take out tumor tissue, spleen and thymus were taken out, the inhibiting rate of tumor, the spleen index and thymus index were detected. Murine serum TNF-α and IFN-γ were detected by ELISA assay.Results：The LD50 of the extract of Qichan targeted slices to mice are 43.26g・kg-1.They are respectively equal to 19.6 times of the daily dosage in clinical. The extract of Qichan targeted slices can remarkably inhibit the growth rate of tumor, the maximal of which was 37.41%. The spleen lymphocyte stimulation index was significantly increased in treatment groups compared with those of 5-Fu groups(P＜0.05). The leveis of TNF-α and IFN-γ were significantly increased in treatment groups compared with those of model groups(P＜0.05). Conclusion: The extract of Qichan targeted slices has good effects on inhibiting tumor growth and enhancing chemotherapy efficacy for tumor-bearing mice. The levels of TNF-α and IFN-γ were increased. These observations give the experimental proof to the clinical of Qichan targeted slices.

Key words:Qichan targeted slices；acute toxicity；hepatocarcinoma 22 solid tumor-bearing mice；TNF-α；IFN-γ

“芪蟾消汤”是浙江中医药大学肿瘤专家张炫炫教授治疗消化道肿瘤的有效验方，有着厚实的临床基础。由于受传统剂型的限制，制约了其更好地发挥疗效。为了进一步提高疗效、减少用药的剂量和降低不良反应，在此验方的基础上将其开发成口服结肠靶向的复方中药新制剂。对于改变剂型后其是否安全有效，有必要进行药效验证。实验前考察芪蟾口服结肠靶向浸膏灌胃给药后，动物所产生的毒性反应，为初步药效学、制剂学及临床用药的安全剂量提供参考依据。通过对小鼠体内实验，分别观察“芪蟾消汤”与芪蟾口服结肠靶向浸膏(高、中、低剂量组)对H22荷瘤小鼠肿瘤模型的抗肿瘤作用，采用酶联免疫法测定TNF-α、IFN-γ来探讨芪蟾口服结肠靶向浸膏（片）抗消化道肿瘤的作用机理，以期能为后续研究工作提供依据和积累相关的药效学资料。

1急性毒性实验

1.1实验材料与方法[1]

1.1.1实验动物动物ICR小鼠，体重18～20g，雌性，清洁级，中国科学院上海实验动物中心/上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物设施合格证SCXK（沪）2007-0005。

1.1.2芪蟾结肠靶向片浸膏制备是由黄芪、生地、蟾皮、苦参等药物组成（5∶3∶3∶3），Ⅰ黄芪饮片加8倍量70%的乙醇，回流提取2次，每次1.5h，回收乙醇至无醇味，并浓缩至料液比为1∶1；Ⅱ黄芪醇提后的药渣挥干乙醇后与生地合并用6倍量水提取3次，每次2h，合并提取液，浓缩后加入95%的乙醇使含醇量达到70%，静置24h，再重复上述操作1次，取沉淀并挥去乙醇至无醇味；Ⅲ干蟾皮粗粉加10倍量80%的乙醇回流提取2次，每次2h，回收乙醇至无醇味，并浓缩至料液比1∶1；Ⅳ苦参饮片加8倍水提取3次，每次2h，合并水提液，经浓缩后加入95%的乙醇使含醇量达到70%，静置24h，取上清液回收乙醇并浓缩至料液比1∶1。将上述各药（液）混合均匀，4℃冰箱保存，备用。

上述各药材购于浙江中医药大学中药饮片厂、杭州华东医药股份有限公司、安徽亳州药材市场，经浙江中医药大学资源鉴定教研室陈孔荣副教授鉴定真伪及质量合格后供使用。

1.1.3预实验将药物以最大浓度（3.3g生药材/mL），最大体积0.72mL灌胃给予5只小鼠，观察毒性反应，探讨下一步的实验方法，结果5只小鼠在1h内全部死亡。另将药物以1.65g生药材/mL，0.18mL灌胃给予5只小鼠，观察毒性反应，结果小鼠未出现死亡。根据以上结果，对药物剂量进行调整，找出Dmax（100%致死量的估计值）为59.4g・kg-1和Dmin（0%致死量的估计值）为14.85g・kg-1。Dmax/Dmin为4。据此，确定正式试验分5组，最高给药剂量为59.4g・kg-1，其他各剂量组间间距为0.7。5个实验组的剂量依次为59.4、41.58、29.11、20.37、14.26g・kg-1。

1.1.4LD50的测定动物室温度为（25±1）℃，小鼠先在实验室分笼饲养，每笼10只，所有小鼠适应性饲养3天，观察其活动、饮食、粪便均无异常后，选取50只进行实验。

50只小鼠随机分成5组，每组10只。动物禁食自由饮水9 h后，灌胃，给予不同剂量的药物浸膏。给药当天详细观察给药后动物的反应情况。连续观察7天，记录小鼠的体重变化等。

1.2实验结果及数据处理

芪蟾口服结肠靶向浸膏对小鼠的急性毒性试验，各组动物死亡数及统计结果见表1。各组小鼠死亡多发生在给药后30min至6h内，表现为耳后毛细血管扩张，呼吸急促，肌肉震颤，直至死亡。立即解剖死亡动物，可见胃肠道内有尚未吸收的药液，其余内脏器官未见明显异常。存活动物当天或次日即可进食，观察7天，体重增长，未见其他毒性反应。

表1芪蟾口服结肠靶向片对小鼠的急性毒性

试验各剂量动物死亡率

分组剂量（g・kg-1）n死亡数（只）死亡率（%）159.410990241.5810440329.1110110420.371000514.261000经LD50软件计算，结果表明，芪蟾口服结肠靶向浸膏小鼠口服的半数致死量（LD50）为43.26g/kg。

1.3小结

芪蟾口服结肠靶向浸膏小鼠口服的半数致死量（LD50）为43.26g/kg，人临床用剂量为11g・d-1，此剂量相当于人临床用剂量的19.6倍。

据急性毒性分级标准[2-4]，经口服LD50>15000mg/kg,可视为无毒或基本无毒。本研究所得芪蟾靶向片（浸膏）小鼠口服LD50为43260mg/kg，据此结果可视为该浸膏（芪蟾口服结肠靶向片浸膏）无毒或基本无毒。

2芪蟾结肠靶向浸膏体内抗肿瘤研究

2.1实验材料与方法

2.1.1实验动物ICR小鼠，体重18～20g，雌性，清洁级，中国科学院上海实验动物中心及上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物设施合格证SCXK（沪）2007-0005。

2.1.2瘤株小鼠移植性肝癌（H22）瘤株，由浙江中医药大学动物实验中心提供，Balb/c小鼠传代留种。

2.1.3药物（1）芪蟾消汤（临床汤剂组）制备是由黄芪、生地、蟾皮、苦参等药物组成（按临床用药比例），将上述药材加6倍量水浸泡1h，提取2次，每次1h，过滤，将两次药液合并，浓缩成每毫升相当于原生药材1克(g・mL-1)。4℃冰箱保存。（2）芪蟾结肠靶向浸膏：实验用药按第一部分试验材料与方法中2.1项下制备。上述各药材均购于浙江中医药大学中药饮片厂、杭州华东医药股份有限公司、安徽亳州药材市场，经浙江中医药大学资源鉴定教研室陈孔荣副教授鉴定真伪及质量合格后供使用。（3）5-氟尿嘧啶注射液：5―氟尿嘧啶注射液，批号1011093，天津金耀氨基酸有限公司，10mL：0.25g，用灭菌生理盐水配成2mg・mL-1的使用品，置于4℃冰箱保存。（4）试剂：Mouse TNFα试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司提供；Mouse IFNγ试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司提供；0.01M PBS缓冲液（配法：1000mL蒸馏水加氯化钠8.5g，Na2HPO4 1.4g，NaH2PO40.2g）。

2.1.4实验器材BN1431分析天平，上海民桥精密科学仪器有限公司；RE-5205旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；电热恒温水浴锅，巩义市予华仪器有限责任公司；微量移液器，德国Eppendorf公司；Model 680型全自动酶标仪，购自美国Bio-Rad公司；5804R离心机，德国Eppendorf公司。

2.2实验方法

2.2.1H22荷瘤小鼠模型建立无菌条件下，抽取接种7～10天的，肿瘤生长情况良好的腹水型Balb/c小鼠腹水，加入6倍量的生理盐水，反复冲打，水平震摇以充分混匀。75%酒精消毒小鼠右前肢腋窝部位，每只皮下接种瘤细胞悬液0.2mL。

2.2.2实验动物分组与给药（1）实验动物分组：雌性ICR小鼠60只，入清洁级实验动物室。所有小鼠适应性饲养1天后，随机分为6组，分别为 ：模型对照组；阳性对照组；临床汤剂组；芪蟾靶向浸膏Ⅰ组（低剂量组） ；芪蟾靶向浸膏Ⅱ组（中剂量组）；芪蟾靶向浸膏Ⅲ组（高剂量组）。（2）给药方法：模型对照组：灌服生理盐水0.4mL/只，每日1次。阳性对照组：5-Fu组腹腔注射5-Fu 0.2mL/只，每日1次。芪蟾消汤组（临床汤剂组）：芪蟾复方水提液8.4g・kg-1・d相当于成人临床日用量。芪蟾靶向浸膏Ⅰ组：灌服芪蟾靶向浸膏，5.5g・kg-1・d-1，相当于成人临床剂量的2.5倍。芪蟾靶向浸膏Ⅱ组：灌服芪蟾靶向浸膏, 11g・kg-1・d-1，相当于成人临床剂量的5倍。芪蟾靶向浸膏Ⅲ组：灌服芪蟾靶向浸膏, 22g・kg-1・d-1，相当于成人临床剂量的10倍。

以上各组小鼠均在相同条件下饲养，自由觅食、饮水。

2.2.3标本采集给药10天，停药次日（即接种第11天），处死小鼠，摘眼球取血法收集血液于干净的Eppendof管中，4℃冰箱中放置12h，2000r/min离心20min，分离血清，血清存入1.5mLEppendof管中，-20℃冰箱中保存。

取血后，解剖全部小鼠，取肿瘤组织、胸腺、脾，电子天平称重。

2.2.4观察和指标检测（1）一般情况：每天定期观察小鼠的精神状态、活动、饮食、毛色及粪便情况，体重每天测量一次并记录。（2）抑瘤率检测：于接种第11天，处死小鼠，解剖，取肿瘤组织，称量，按以下公式计算抑瘤率：抑瘤率%=（1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重）×100%。（3）脏器指数检测：于接种第11天，处死动物，取出小鼠胸腺及脾脏后分别称重，得到胸腺指数（100×胸腺重量/体重）及脾指数（100×脾脏重量/体重）。（4）细胞因子TNF-α，IFN-γ检测：采用酶联免疫ELISA法检测小鼠血清中细胞因子TNF-α，IFN-γ水平，具体检测步骤按照ELISA试剂盒说明书进行操作。

2.2.5统计学处理所得数据均采用平均值±标准差(±s)表示，组间比较用t检验。

2.3结果

2.3.1各实验组小鼠一般状况观察接受实验的各组小鼠，在肿瘤接种后前3天，未发现明显异常及差别，第4天开始，各组小鼠的右前肢腋窝下均可摸到米粒大小的肿瘤块，模型对照组、临床汤剂组小鼠均出现活动减少，觅食不积极。芪蟾靶向浸膏各实验组一般情况良好，小鼠比较活泼，觅食积极。此后各实验组小鼠肿瘤逐日增大，其中以模型对照组增大较为明显。芪蟾靶向浸膏各实验组状况良好，小鼠无明显消瘦和竖毛现象，但觅食有所减少。随肿瘤瘤体增大，各组小鼠活动减慢。

2.3.2各实验组抑瘤率比较根据表1结果显示， 临床汤剂组、芪蟾靶向浸膏3个剂量组的抑瘤率分别为22.06%、37.41%、33.21%、31.85%。结果提示芪蟾靶向浸膏各剂量组抑瘤效果优于临床汤剂组，尤以低剂量抑瘤率最为明显。与模型对照组比较，5-Fu组，临床汤剂组，芪蟾靶向浸膏3个剂量组的瘤重明显的低于模型对照组（P＜0.01)；与临床汤剂组比较，芪蟾靶向浸膏Ⅰ组、Ⅱ组的瘤重低于临床汤剂组（P＜0.05)，抑瘤效果好于临床汤剂组。见表1。

2.3.3各组脏器指数比较如表2所示，与模型对照组，临床汤剂组、芪蟾靶向浸膏各组比较，5-Fu组胸腺指数、脾指数降低（P＜0.05）。与模型对照组相比，临床汤剂组及芪蟾靶向浸膏各剂量组的胸腺指数，脾指数增加。

表1各组小鼠瘤重及抑瘤率比较(n=10, ±s)

组别药物

（g・kg-1・d-1）瘤重（g）抑瘤率

（%）模型对照组NS1.7211±0.0568-5-Fu组0.021.0236±0.1354**40.52临床汤剂组8.41.3414±0.3202**22.06芪蟾靶向浸膏Ⅰ组5.51.0772±0.1812**##37.41芪蟾靶向浸膏Ⅱ组111.1495±0.1915**#33.21芪蟾靶向浸膏Ⅲ组221.1729±0.2199**31.85注：与模型对照组比较，**P＜0.01；与5-Fu组比较，P＜0.05；与临床汤剂组比较，##P＜0.01，#P＜0.05。

表2各组小鼠脏器指数比较(n=10, ±s)

组别药物

（g・kg-1・d-1）胸腺指数

（mg/10g体重）脾指数

（mg/10g体重）模型对照组NS0.1263±0.0190.5445±0.0935-Fu组0.020.1113±0.0180.4727±0.097临床汤剂组8.40.1402±0.026*0.5628±0.096*芪蟾靶向浸膏Ⅰ组5.50.1479±0.021**0.5892±0.086**芪蟾靶向浸膏Ⅱ组110.1427±0.027**0.5726±0.073*芪蟾靶向浸膏Ⅲ组220.1366±0.031*0.5409±0.096注：与5-Fu比较，**P＜0.01，*P＜0.05。

2.3.4各组小鼠细胞因子IFN-γTNF-α的比较根据表3结果显示，芪蟾靶向浸膏的3个剂量均能明显提高H22荷瘤小鼠的IFN-γ，TNF-α活性（P＜0.05），表明其对荷瘤小鼠免疫功能具有有效的保护作用。

2.4分析与讨论

现代医学研究表明，细胞失控性增殖以及细胞增殖与丢失的失衡是肿瘤生长的基本生物学特征，而这种失衡涉及细胞增殖、分化和凋亡，现已成为肿瘤发生的重要机制之一[5]。中医中药治疗肿瘤，历史悠久，应用复方中药或采用中西结合治疗肿瘤疗效确切，同时能减轻放、化疗引起的不良反应。因此，从临床有效方药中寻找抗肿瘤药物，抑制肿瘤细胞增殖、诱导分化和促进凋亡，是目前研发抗肿瘤新药的重要途径之一。

动物造模是否成功是本次实验的关键环节。迄今为止，动物移植性肿瘤实验方法，仍是研究药物抗肿瘤作用最通用的方法，肿瘤生长抑制率是评价肿瘤疗效的重要指标。H22瘤细胞较易在小鼠体内移植，接种于腹腔呈腹水型增长，具有移植成活率高，均一性好，无自发性消退，成瘤稳定，易于操作等优点，是目前肿瘤研究中最常用的模型[6]。但据文献报道及本实验观察到接种相同瘤细胞的同一实验组内的小鼠移植肿瘤重量差异较大，故本实验中采用水平直线振摇方式混匀，从抽取腹水时开始到移植完最后一只小鼠的总时间控制在2h以内[7]。在瘤细胞接种后第4天，各实验组小鼠的右前肢腋窝下均可摸到米粒大小的肿瘤块，且逐渐长大，肉眼观察局部隆起，瘤结节向胸廓蔓延。模型对照组、临床汤剂组小鼠均出现活动减少，觅食不积极。芪蟾靶向浸膏各实验组及5-Fu组小鼠瘤结节形成时间及生长势头均不及模型对照组。随肿瘤瘤体增大，各实验组小鼠活动减慢。说明本实验的动物造模型是成功的。结果显示，芪蟾靶向浸膏各组具有明显的抗肿瘤作用，其抗肿瘤效果优于临床汤剂组（P＜0.05），并可减少患者的用药量，降低不良反应，提高疗效。

胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官，二者对细胞毒剂药物高度敏感，在化疗药物作用下明显萎缩，严重影响其功能，造成其组织结构发生严重损伤，从而抑制机体的免疫和抗病能力。因此，胸腺，脾脏重量可在一定程度上反映机体免疫功能的强弱，并可作为药物对免疫功能的初步观察指标[8]。本实验中5-Fu组小鼠的胸腺指数和脾指数与模型对照组相比有所降低，芪蟾靶向浸膏各组的上述指标与5-Fu组相比有明显增高（P＜0.05），与模型对照组比较无显著性差异（P＞0.05），提示临床汤剂组和芪蟾靶向浸膏各组均有提升机体的免疫功能，其毒性远小于化疗药物。

IFN具有广谱的抗病毒、免疫调节和抗肿瘤作用。IFN-γ主要由活化的T细胞和NK细胞产生，据报道其可明显增强MHC-I类和MHC-Ⅱ类抗原的表达、促进T细胞和B细胞的分化、增强NK细胞的杀伤活性、充分激活单核-巨噬细胞，抑制细胞生长和促进分化作用，并通过抑制癌基因(如c-ymc和c-fos)的表达、增强机体的免疫原性及抑制肿瘤新生血管形成等而发挥抗肿瘤效应[9-10]。本课题通过酶联免疫ELISA法测定H22荷瘤小鼠的TNF-α，IFN-γ，结果表明芪蟾靶向浸膏对荷瘤宿主细胞免疫具有明显的保护和促进作用。

参考文献

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