时间：2022-05-19 02:47:13
[摘要]目的：探讨早期生长反应因子-1（Egr-1）的诱骗性脱氧核苷酸(EODN)对实验性大鼠动脉损伤后血管内皮功能的影响。方法：Wistar大白鼠96只，随机分为假手术组、对照组1、对照组2和基因治疗组（各24只）。行左颈总动脉内膜剥脱术后，治疗组经带孔球囊导管末端将含有FITC标记的EODN 500 μｇ，转染试剂FuGENE6 30 μl的1 mmol/L MgCl2液200 μl局部加压注入至损伤的血管节段内，使其在局部作用１５ min； 对照组1局部注入200 μl的1 mmol/L MgCl2液；对照组2局部注入含30 μl FuGENE6 Reagent的1 mmol/L MgCl2液200 μl。分别于3，7，14，21 d每组各处死动物6只，处死前心脏取血检测一氧化氮、一氧化氮合酶、 内皮素浓度。结果：与两对照组比较，EODN治疗组血清一氧化氮和一氧化氮合酶含量均增高（P
[关键词]早期生长反应因子-1；诱骗性脱氧核苷酸；血管内皮；基因治疗
[中图分类号]R363 [文献标识码]B[文章编号]1673-7210（2007）05（c）-151-02
传统药物（如血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体阻断剂、抗血小板药等）在预防介入治疗后再狭窄方面均不理想。本研究拟通过观察早期生长反应因子-1（early growth response factor-1,Egr-1）的诱骗性脱氧核苷酸（EODN）对动脉损伤后血清一氧化氮(nitric oxide,NO)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)和血浆内皮素(endothelin,ET)水平的影响，探讨EODN对血管内皮的保护作用和在预防血管再狭窄方面的作用。
1 材料与方法
1.1 大鼠动脉损伤的模型制作
雄性Wistar大白鼠96只（中国医科大学实验动物中心提供）， 体重350～400 g。麻醉后，颈正中切开，钝性分离左颈动脉，血管夹暂时阻断左颈总动脉近心、远心端血流，用2F导管（购自美国Baxter healthcare corporation）从颈外动脉插入左颈总动脉内，推入0.2 ml生理盐水充盈2 F导管气囊，反复抽拉球囊3次，造成左颈总动脉内膜损伤。从导管末端将含有FITC标记的EODN 500 μｇ（上海博亚生物技术有限公司合成）、转染试剂FuGENE6（购自Roche公司）30 μl的MgCl2液200 μl局部注入至损伤的血管节段内，使其在局部作用１５ min。结扎颈外动脉，恢复血流，缝合颈部创口。术后局部使用青霉素以预防感染，喂食标准饲料，自由饮水。
1.2分组及处理
96只雄性Wistar大白鼠随机分为4组，每组24只。治疗组经带孔球囊导管末端将含有FITC标记的EODN 500μｇ，转染试剂FuGENE6 30 μl的MgCl2液200 μl局部加压注入至损伤的血管节段内，使其在局部作用15 min；对照组1局部注入200 μl的1mmol/L MgCl2液；对照组2局部注入含30 μl FuGENE6 Reagent 的1mmol/L MgCl2液200 μl；假手术组只进行颈动脉结扎，但不插入导管，即不造成动脉内膜损伤。而对照组1和对照组2分别为稀释液和转染液而设计的对照。术后3、7、14、21 d分别处理各组动物6只，取治疗局部的血管迅速放入液氮冷冻，-70℃保存，用于总RNA的提取和组织蛋白的检测。
1.3 在体EODN的转染
室温下分别将EODN 500 μｇ与转染试剂FuGENE6 30 μl充分混合成复合物，溶于1mmol/L MgCl2液170 μl中，在制作血管球囊损伤模型的同时，从颈外动脉给予。可在荧光显微镜下观察转染情况，转染治疗24 h后处死大鼠1只，立即取治疗局部的血管放入液氮中，经冰冻切片（片厚5 μm）后，避光放置于荧光显微镜下观察，若经460 nm波长激发血管内膜及中膜发出绿光，则证明转染成功。
1.4 NO、NOS、ET生物化学检测
大鼠处死前心脏取动脉血4 ml注入无抗凝剂和有抗凝剂试管中，离心后取血清及血浆备检。
血清NO的测定：硝酸还原酶法，按NO检测试剂盒（购于南京聚力生物医学工程研究所）说明书进行操作。血清NOS的测定：采用化学比色法，按NOS检测试剂盒（购于南京聚力生物医学工程研究所）说明书进行操作。血浆ET浓度测定：用放射免疫分析法测定血浆ET浓度，操作按分析试剂盒（购于北京东亚免疫技术研究所）操作说明书进行。
1.5 统计学处理
所有数据采用SPSS 11.0统计软件处理，所有变量以x±s表示，组间和组内比较采用方差分析，P
2 结果
2.1 在体EODN转染的鉴定
转染治疗24 h后，治疗局部血管的冰冻切片避光置于荧光显微镜下，经激发可见血管内膜及中膜发出绿光，证明在体基因转染成功。
2.2 血清NO，NOS及ET浓度测定结果
球囊损伤大鼠颈总动脉后3、7、14、21 d，治疗组血清NOS含量较两对照组高，且均高于假手术组。治疗组血清NO含量较两对照组高，但较假手术组明显降低。治疗组血浆ET浓度较两对照组低；治疗组和两对照组血浆ET浓度较假手术组高；21 d治疗组及两对照组血浆ET浓度已开始降低（表1）。
3 讨论
经皮冠状动脉成形术是目前治疗冠心病最有效的手段之一，但术后半年内30%～50%再狭窄率影响其远期效果。目前认为再狭窄包括血栓形成、内膜增生和血管重塑三个相互独立而又互有联系的环节。正常血管内膜主要有屏障、接受和传递信息及分泌功能，其结构的完整性和功能的正常对维持血管壁的光滑和血流的通畅具有重要意义，而经皮冠状动脉成形术使血管内皮的完整性受到破坏，导致内皮下基质暴露引起血小板的聚集、活化、释放生物因子，介导一系列的生物学反应，诱导再狭窄，同时血管内皮细胞的分泌功能发生紊乱。NO、NOS和ET均是反映内皮分泌作用的重要指标，对血管舒缩的调节起到关键作用。NO是一种具有多种生物学活性的细胞因子，生理状态下能扩张血管，增加血流量，抑制血管内皮细胞黏附分子的表达，抑制血小板黏附聚集，防止附壁血栓的形成，抑制白细胞黏附激活，减轻血管壁炎症反应，抑制平滑肌细胞分裂增殖并促进其发生凋亡，减少新生内膜的形成；NOS是NO合成的限速酶，在NOS的作用下，体内的左旋精氨酸和分子氧发生反应，脱去左旋胍氨酸而释放NO；ET是迄今为止体内最强的缩血管活性肽，同时具有较强的生长因子样活性，通过自分泌或旁分泌方式促进血管平滑肌细胞增生。有研究发现血管内皮细胞损伤后造成NOS的大量破坏，NO合成减少，内膜增生较重；而增加NO的水平则内膜增生减轻，同样血管内皮细胞损伤后造成ET释放增加，因此，有关基因转染干预血管内皮细胞功能的研究正受到人们的重视。
Egr-1是一种锌指结构因子，有研究表明在各种外界刺激下（如：动脉损伤）Egr-1激活，从而诱导血管平滑肌（VSMC）的分裂、增殖和内膜增生。EODN通常是一些互补的ＤＮＡ或ＲＮＡ的短序列(一般＜３０ bp），它们能与特定的mRNA杂交而形成杂交双链。EODN可以用来分析那些促进细胞增殖或促进细胞进入细胞周期的基因，并能抑制那些与细胞复制有关的基因表达。EODN与目标序列高特异性结合，对细胞本身无明显毒性，是一种顺式作用元件，与转录因子DNA结合位点的序列相同或相似，在与转录因子与内源顺式DNA序列元件竞争，诱骗转录因子与它结合，下调转录因子所调控的基因表达，EODN抑制目标基因的表达，但却不影响其他核苷酸序列或细胞内蛋白质的表达。本研究设计大鼠Egr-1特异的诱编性脱氧核苷酸，观察其对血管内皮细胞功能的影响。实验发现，应用EODN治疗后21 d内可以减少血管损伤后ET的释放，但由于血管内膜损伤后仍释放大量ET，所以仍较正常组增高，而且新生内膜也分泌ET，刺激平滑肌增生，21 d时血管内皮功能逐渐恢复。实验亦发现EODN可以增加血管损伤后NO、NOS的释放量， NO与NOS的增加一致，与NOS催化L-精氨酸合成释放NO的观点一致，而血管损伤后治疗组及对照组NOS的释放量均高于假手术组，考虑是血管损伤后为维持损伤血管的张力及减少血栓形成的一种代偿机制。因此，EODN对血管内皮细胞功能的影响考虑是EODN通过抑制Egr-1的合成，从而抑制血管平滑肌和内膜增生，间接发挥改善血管内皮细胞功能的作用。
本实验结果表明，EODN阻断血管动脉损伤后Egr-1产生，从而间接影响血管内皮细胞功能和Egr-1对血管内皮和平滑肌细胞的诱导增生作用。应用EODN后ET分泌量下降，NO及NOS的含量增高，提示应用EODN可以减少血管损伤后ET释放，增加血管损伤后NO、NOS释放，EODN这种对动脉损伤后血管内皮功能的影响在经皮冠状动脉成形术后即刻应用有积极意义，但其作用机制有待进一步深入研究。
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（收稿日期：2007-03-25）
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