锥栗植株再生体系的建立

摘 要： 【目的】为了建立锥栗再生体系，【方法】以锥栗胚为外植体，分析不同基因型、基本培养基及激素组合对锥栗不定芽的诱导、增殖和生根的影响。【结果】结果表明，油榛是锥栗组织培养最佳的基因型；锥栗不定芽诱导的最适培养基为M（NH4NO3 804 mg・L-1+ KNO3 1011 mg・L-1 +FeSO4・H2O 27.8 mg・L-1 + 1/2MS 其余无机盐 + MS有机）+6-BA 2.0 mg・L-1+IBA 0.2 mg・L-1，其出芽率为76%；芽增殖的最佳培养基为M（同上）+6-BA 0.5 mg・L-1+IBA 0.1 mg・L-1，其增殖倍数达18；诱导生根的最佳培养基为M（同上）+IBA 0.5 mg・L-1，其生根率为48%。【结论】运用上述体系可获得完整锥栗再生植株。

关键词： 锥栗； 组织培养； 植株再生

中图分类号：S664.2 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪01-0105-05

锥栗（Castanea henryi）属壳斗科栗属，是我国著名的木本果材兼用树种。其人工林主要集中在闽北和浙南，已成为闽北地区重要的经济林树种之一[1]。锥栗果实外形光洁美观、果肉细嫩香甜， 含有淀粉、糖、蛋白质等主要营养成分及18种钙、锌、磷、钾、铁等矿物质，深受消费者青睐，在国际市场中具有强大的竞争力。锥栗栽培品种多且乱，为了保持其优良特性，目前繁殖大部分采用扦插、嫁接等无性繁殖方法，但扦插受限于生根率和优质插条的数量，嫁接受砧木与接穗亲和力、接穗数量和生活力以及生长环境等因素的影响，同时扦插和嫁接出苗周期长，造成它们扩繁速度慢，育苗效率低，在种质资源有限的条件下不能满足锥栗良种的大量推广[2]。而组织培养快速繁殖苗木，不仅可以加速良种繁育，而且在离体条件下群体大，实验条件易于控制，不受时间和季节的限制，并在一定程度上保持母本的优良性状。近来学者对锥栗的生理生化、良种繁育、生态、栽培技术、病虫害、加工利用等方面开展了研究[3]，但对锥栗组织培养的研究相对较少，迄今为止，未见锥栗再生体系建立的研究报道[4-5]。我们进行锥栗组培快繁技术和再生体系的研究，旨在为遗传改良研究提供基础和进一步加快锥栗优良品种的推广应用。

1 材料和方法

1.1 材料

14个锥栗品种均来自福建省建瓯市水源乡，每份材料采集健康饱满的种子 200 粒。

1.2 方法

1.2.1 无菌外植体的建立 将锥栗种子放在流水中冲洗 10 min，剥去果壳，取出种仁，经 70% 酒精浸润 30s 左右，移到含有吐温 80 的 0.2%HgCI2 溶液中消毒 8 min，接着用无菌水摇洗4～5遍，每次摇洗时间不少于 1 min，放到灭菌滤纸上， 吸干表面水分[5]。在超净工作台上用解剖刀切开种仁，取出种胚接种到初代培养基上。

1.2.2 基因型筛选 将14个供试材料（表1）的成熟胚为材料，消毒后，接种于MS+BA1 mg・L-1+NAA 0.5 mg・L-1 培养基中[5]，其中蔗糖 40 g・L-1，琼脂 7g・L-1，pH 为 5.5。每处理接 50 个外植体，重复 3 次。接种材料置于温度 （26±1）℃，空气相对湿度 50%～60%，光照 12 h・d-1，光照度为1 500～2 000 lx。30 d 后统计分化率，观察材料状态。

1.2.3 基本培养基 以油榛的成熟胚为材料，消毒后，接种于按无机盐和有机盐含量高低选取White、WPM、MS、1/2MS（1/2的大量元素）、改良 MS 以及 M（NH4NO3 804 mg・L-1+ KNO3 1 011 mg・L-1+ FeSO4・H2O 27.8 mg・L-1+ 1/2MS 其余无机盐 + MS有机） 这 6 种基本培养基作为锥栗胚诱导、分化、增殖的基本培养基，分别加入激素 BA 1 mg・L-1和 NAA 0.5 mg・L-1，其余条件同上。1 个月后观察。

1.2.4 丛生芽诱导 以油榛的成熟胚为材料，消毒后，取无菌胚接种于培养基上。基本培养基为M，添加不同的分裂素浓度 6-BA（1、2 、0.5 mg・L-1），不同类型的生长素 （IAA、NAA、IBA） 及不同浓度的 IBA（0.1、0.2、0.5 mg・L-1）[4]进行组合实验。其余条件同上。1 个月后观察。

1.2.5 不定芽的增殖 将初代培养的芽长至 5～6 个叶芽时，分割，接入增殖培养基。以 M 为基本培养，蔗糖 30 g・L-1、琼脂 6 g ・L-1，pH 5.5，附加 6-BA（0.25、0.5、1 mg・L-1）、IBA（0.1、0.2、0.3 mg・L-1）、0.1 mg・L-1（IAA、NAA、IBA）进行激素组合实验。培养条件同上。观察记录，30 d 后继代1次。

1.2.6 生根培养 不定芽伸长至2.0～3.0 cm时自基部切下，移至生根培养基。基本培养基为White、1/2 MS、M。蔗糖 30 g・L-1，琼脂 6 g・L-1， pH5.5，附加 IBA（0.3、0.5、0.7 mg・L-1）、0.5 mg・L-1（IAA、NAA、IBA）、0.1 mg・L-1 6-BA 进行组合实验。培养条件同上。培养30 d 后，记录试验结果，观察记录每个组合不定芽的生根状况及芽的生长反应情况。生根率（%）=生根苗数量/外植体数量×100。

1.2.7 炼苗及移栽 移栽时选择粗壮、均一、长势好，无变异的试管苗，先移到自然光的环境中炼苗 2 d，再开口炼苗 2 d 后移栽。在瓶内倒入适量清水，摇动使培养基与幼苗分离，用镊子把幼苗取出，迅速用水冲洗粘附在根部的培养基，移植于沙质中，用 1/2MS 溶液保湿培养 15 d 后，移栽到营养土中正常栽培管理。

2 结果与分析

2.1 基因型对锥栗不定芽诱导的影响

将 14 个供试材料的胚外植体消毒后，接种于 MS+BA1 mg・L-1+NAA0.5 mg・L-1分化培养基中， 7 d 左右外植体膨大，14 d 左右可见绿色的芽点（图版-A），1 个月后14个品种的芽分化率为 0.12～0.72，品种之间存在着明显差异（表 1），长势见（图版-B）。‘坝头子’、‘欧宁子’、‘处署红’的长势最差，‘油栗子’、‘乌榛’长势在 14 个品种中最好。综合外植体分化率和长势，得出‘油榛’是最好的实验材料。

2.2 基本培养基对锥栗不定芽的影响

以‘油榛’胚为材料，选用附加激素的 6 种培养基进行培养，1 个月后进行统计（表 2）发现，芽分化率 0.32～0.84，差异明显。同时分化出的不定芽长势差异也较大，White、1/2MS 培养基芽势弱，MS 分化出的不定芽壮且伴有大量愈伤组织生长，WPM、改良 MS 褐变严重，M 培养基分化出的不定芽壮，但伴有少量愈伤组织。

2.3 不同激素组合对锥栗不定芽分化诱导的影响

以‘油榛’的胚为材料，以M为基本培养基，分别附加不同激素组合进行不定芽诱导，每处理 50 个外植体。1 个月后观察不定芽分化率（表3）， 1.0 mg・L-1 6-BA 与0.5 mg・L-1 IBA 组合时分化率最高，其次分别为 0.5 mg・L-1 NAA 和 0.5 mg・L-1 IAA。在IBA为 0.5 mg・L-1，2 mg・L-1的 6-BA 分化率高于 1 mg・L-1的6-BA的分化率。在 6-BA 为 2.0 mg・L-1，IBA 为 0.2 mg・L-1 时，胚不定芽分化率最高，达到 92%。

故不定芽分化的培养基为 M+6-BA 2.0 mg・L-1+IBA 0.2 mg・L-1+蔗糖4.0%+琼脂粉0.6%，pH 5.5。

2.4 不同激素组合对锥栗不定芽的增殖的影响

将不定芽分别接种含有不同激素种类及其配比的 M 培养基中，进行增殖实验，每个处理50 个外植体，一个月后观察（图版-C，D，表4）。各个处理之间的增殖倍数变化幅度大，为1～18，其中倍数最高的是6-BA 0.5 mg・L-1 和IBA 0.1 mg・L-1的组合。从生长状况看，不同类型的生长素对芽生长影响不同，IBA 增殖的芽正常，IAA 促进节间伸长，NAA 有利于根毛分化；高浓度的分裂素促进愈伤形成；适当浓度的IBA 有利于不定芽的增殖。

故芽增殖的最优培养基为 M+6-BA0.5 mg・L-1+IBA 0.1 mg・L-1+蔗糖3.0%+琼脂粉0.6%，pH 5.5。

2.5 不同激素组合对锥栗不定芽的生根的影响

将不定芽分别接种M基本培养基中，每处理 50 个外植体。 15 d 左右不定根开始形成，1 个月后形成发达根系（图版-E，F），并观察其生根率和根的生长状况（表5）。从整体上看，锥栗的生根率比较低。3种基本培养基生根率最高的是M，其次是 1/2MS，最低的是 White 基本培养基，为0。从根的生长状况看，M基本培养基生根质量最好。在锥栗生根中，分裂素起抑制作用，生根率为 0。3种生长素的生根作用存在着差异，生根率最高的是 IBA，且根系质量也最好；最低的是NAA为 0.12。不同浓度 IBA 对生根影响也有明显差异，过高或过低都不利于锥栗不定芽的生根。

综上所述，最优生根培养基是 M +IBA0.5 mg・L-1+蔗糖3.0%+琼脂粉0.6%，pH 5.5。

2.6 移栽成苗

移栽时，选择根长 3 cm 左右，粗壮、均一、长势好，无变异的试管苗，先移到自然光的环境中炼苗 2 d，再开口炼苗 2 d 后移栽。在瓶内倒入适量清水，摇动使培养基与幼苗分离，用镊子把幼苗取出，迅速用水冲洗根部，移植于沙质中（图版-G），用 1/2MS 溶液保湿培养 15 d 后，移栽到营养土中正常栽培管理。成活率 75%。

3 讨 论

前人[6-8]报道，基因型的选择对于能否获得再生植株十分重要。本研究得到，以胚为外植体，锥栗不同品种在不定芽诱导和分化中存在明显差异。‘油榛’分化率最高，达到 0.72；‘坝头子’最低，仅为 0.12。这是因为锥栗不同品种遗传控制再生能力或对诱导条件的要求不同存在差异[9]，从而造成了不同基因型供体植株发育状态的差异。

基本培养基是植物组织培养重要的基质，由于各种植物的遗传特性，生物学特性和生态学特性不一样，因而各种植物需求的营养成分也不尽相同，对培养基成分要求也有差异[10]，同时器官发生的不同时期对培养基的要求是不一样的[11]。本课题组在锥栗组织培养初期得出，适合锥栗胚分化的基本培养基是 White[4]，但本次试验得出锥栗组织培养最适宜的基本培养基为M。这是因为虽然 White 基本培养基中的分化率很高，但芽的质量不好，有可能是 White 基本培养基中无机盐含量低有利于胚分化，有机质含量不高造成芽生长不好。而M基本培养基用有机质含量高的 MS作基础降低大量元素含量，即 NH4NO3 804 mg・L-1+ KNO31011 mg・L-1 + FeSO4・H2O 27.8 mg・L-1+ 1/2MS 其余无机盐 + MS有机。因此是最适宜的基本培养基是 M。同时也说明锥栗组培适合于总盐量中等及铵态氮和硝态氨的比值为1的培养基。

在木本植物器官发生过程中，细胞分裂素和生长素对芽的诱导和生长发育均起着重要的作用，一般诱导不定芽的形成时细胞分裂素高于生长素的用量或只用细胞分裂素；而诱导不定根发生只用生长素或配合使用较低浓度的细胞分裂素[12]。本试验结果也类似，芽分化中 6-BA 2.0 mg・L-1+IBA0.2 mg・L-1组合效果好，芽增殖实验中 6-BA0.5 mg・L-1+IBA 0.1 mg・L-1的组合效果最好。生根激素 IBA0.5 mg・L-1。在激素配比中，分裂素与生长素的比例为 10 时，锥栗分化不定芽效果最好；比例为 5 时，增殖效果最好；但分裂素对锥栗不定芽生根有抑制作用。这有可能是因为随着继代次数的增多，激素的含量和比例相对降低[13-14]，且由于有不同种类植物激素的生理效应相互促进和相互拮抗，影响植物生理生化的合成、运输、代谢及效应导致每一个培养阶段只需一定范围的浓度和配比[15]。在 6-BA 与不同类型的生长素组合中，IBA 对锥栗组织培养效果最好，其次是 NAA，最后是 IAA。这也许是IAA是一种内源激素，在外界环境中易分解的原因[16-17]。

在锥栗组织培养研究过程中也存在一些问题。首先锥栗不定芽分化率不高。这有可能是因为锥栗为多年生的木本植物，次生代谢旺盛且复杂，易导致组培过程中发生褐变。本实验通过基因型选择和基本培养基中大量元素的调节，在保证有效的控制褐变的前题下，提高不定芽分化率。其次生根率低，是因为锥栗本身就是难生根的物种[1]，而且对于木本成年树来说，不定芽生根的问题是整个培养过程中最难克服的[18]。（本文图版见插3）

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