益母草生物碱对心肌梗死大鼠心功能及肌浆网钙泵的活性及其蛋白水平的影响

摘要：目的探讨益母草生物碱对大鼠心肌梗死后心功能保护作用的机制：方法 采用左冠状动脉前降支结扎制作大鼠心肌梗死模型，通过大鼠血流动力学指标以及心肌肌浆网钙泵的活性(SERCA2a)及其蛋白水平来反映益母草生物碱对大鼠心肌梗死后心功能的影响不明显(P

关键词：益母草生物碱；心肌梗死，急性；血流动力学；肌浆网钙泵

中图分类号：R541.4 R285.5

文献标识码：A

文章编号：1672 1349(2007)05―0409―03

益母草为唇形科益母草属(Leonurus heteropyllus Sweel)植物，现代药理学研究表明，益母草有着广泛的生物学活性，其主要活性成分为生物碱、总黄酮、二萜类等。益母草生物碱对异丙肾上腺素造成的大鼠心肌损伤具有保护作用，并能改善大鼠冠状动脉左前降支结扎造成心肌梗死后的心功能。本次研究目的在于探讨益母草生物碱改善冠状动脉结扎致心肌梗死后模型大鼠心功能作用的可能机制。

1 材料与方法

1．1实验材料

1．1．1动物清洁级SD雄性大鼠，体重(300±20)g，由上海中国科学院实验动物中心提供(动物合格证号：02569)。

1．1．2主要仪器Powerlab8/30多道生理记录仪，澳大利亚埃德仪器公司生产；AC－C8小动物呼吸机，上海奥尔科生物技术有限公司生产；miniVE垂直电泳系统，安玛西亚公司生产；TS－1型脱色摇床，江苏海门市其林贝尔仪器有限公司生产；DU－800分光光度计，美国贝克曼库尔特有限公司生产。

1．1．3药品益母草生物碱由上海中医药大学中药制药工程实验室提供，纯度达95％，每毫升含生药10 g；卡维地洛(Carvedil01)，每片25mg，德国曼海姆生产(批号：MH6600806)，上海罗氏制药有限公司分装(分装批号：SH0007)。

1．1．4试剂BCA蛋白浓度测定试剂盒、组织裂解液，碧云大生物技术研究所提供；甘油醛－3－磷酸脱氢酶(GAPDH)，上海康成生物工程有限公司提供；小鼠抗大鼠肌浆网钙泵钙ATP酶(SERCA2a)，美国ABR公司提供。

1．2模型制作参照冠状动脉结扎法并略加改动。大鼠用3％戊巴比妥钠(45mg/kg)腹腔麻醉后，仰卧固定于手术台上，气管插管后，给予人工呼吸(频率90/min，潮气量16mL/min～20mL/min)。左胸第4肋间逐层分离，左心耳下缘及肺动脉圆锥之间，结扎左冠状动脉左前降支。结扎后观察心电图变化，以ST段持续抬高作为造模成功标志。假手术组进针同模型组，但不结扎。

1．3分组与给药清洁组SD大鼠共62只，正常组10只，假结扎组12只，其中因手术意外死亡1只，其余40只大鼠于造模后3d之内死亡9只，存活31只，手术存活率为77.5％?存活大鼠分为模型组、卡维地洛组及益母草生物碱组(生物碱组)，每组10只，另1只丢弃。给药方法：模型组以生理盐水灌胃；卡维地洛组按30mg/(kg・d)剂量灌胃；生物碱组按30g/(kg・d)剂量(相当于人体用药量的5倍)灌胃。正常组及假结扎组均给予生盐水灌胃。

1．4观察指标

1．4．1 血流动力学榆测 各组大鼠给药4周后，行右侧颈总动脉插管，记录心率、动脉平均压、舒张压及收缩压后，行左心室插管，记录左室舒张末压(LVEI)P)、左室收缩压(I.VSP)、左室内压最大上升速率(+dp/dtmax)，左室内压最大下降率(－dp／dtmax)。

1．4．2 大鼠心肌组织SERCA2a活性测定 取左心室肌组织5.0mg加0.5mL组织匀浆液(含PMSF)匀浆，4℃，12000r/min，离心5min，取上清液采用BCA法测定蛋白浓度，调节样品蛋白浓度至1000pg／mL。30℃水浴10 min，加入20pLATP，30s后加入20uL样品，混匀后45 s后测定OD值。每个样品均测定不同CaZ+浓度下的OD值，制作曲线后，计算最大值。

1．4．3大鼠心肌组织SERCA2a相对表达量测定样品制备同前。制备SDS－PAGE胶，蛋白上样量为50ug，分离胶用100 V电泳，电泳至溴酚蓝刚跑出即终止电泳。将胶片扫描后，通过图像分析软什测定日的条带及内参的光密度值，计算日的蛋白的表达量。

1．5统计学处理计量资料以均数±标准差(x±s)表示，多组间两两比较采用单因素方差分析。并且采用SPSS 12.0以及Prism 4.0生物医学统计软件分析和制图。

2 结果

2．1实验大鼠一般情况实验大鼠共62只，正常组10只，假结扎组12只，其中因手术意外死亡1只，其余40只大鼠于造模后3d之内死亡9只，存活31只，手术存活率为775％。动物实验结束后，因梗死面积不符合要求而排除的大鼠有4只，其中模型组2只，生物碱组2只。术后2周始，模型组大鼠逐渐出现毛发光泽不良，少数大鼠活动能力下降。

2．2各组大鼠动脉平均压、舒张压、收缩压及心率比较模型组大鼠动脉平均压、动脉舒张压均明显低于正常组与假结扎组(P0.05)。生物碱组大鼠动脉平均压、动脉收缩压、动脉舒张压以及心率与模型组及卡维地洛比较无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

2．3各组大鼠血流动力学比较模型组大鼠左室收缩压、左室内压最大上升速率以及左室内压最大下降速率均明显低于假结扎组，而左室舒张未压却明显高于假结扎组与正常扎(P

2．4 各组人鼠心肌组织SERCA2a活性及含量比较 结果显示，模型组SERCA2a活性明显低于正常组及似结扎组(P

表2各组大鼠心肌组织SFRCA2a活性及含量比较(x±s)

3 讨论

心力衰竭是多种心血管疾病的终末期表现，而心肌梗死后的心力衰竭已成为临床心力衰竭最常见的类型。在心肌梗死后发展成心力哀竭的过程中，机体发生了大量的神经内分泌及基因等方面的变化，最终导致心肌收缩舒张性能下降，血流动力学出现异常。本实验也发现，大鼠经冠状动脉前降支结扎造成心肌梗死后模型大鼠出现了明显的血流动力学指标的异常，以反映心肌收缩与舒张性能的±dp／dtmax变化最为明显。研究表明，Ca2+在维持心肌细胞的收缩、舒张功能中起着决定性的作用。其中，心肌肌浆网(sarcoplasmic reticulum，SR)中的SERCA2a在钙离子周期性变化中起着关键性的作用。心脏舒张时，SERCA2a的主要作用就是降低细胞内钙离子的浓度，它将细胞浆内钙离子泵入肌浆网内。研究表明，在心肌缺血、压力负荷导致的心肌肥大及心力哀竭的动物模型及严重的心肌肥大及心力衰竭病人中，心肌股浆网SERCA2a的mRNA及蛋白水平均降低，反映了心肌细胞在维持最适宜细胞内CaZ+浓度方向的缺陷。而Frank等发现心力衰竭病人左心室肌与正常心肌相比SERCA2a mRNA和蚩白表达未见明显改变，但SERCA2a活性则降低32％，心肌肌浆网摄取CaZ+功能的卜降，胞浆内CaZ+转运受到不同程度的障碍，CaZ+稳态被破坏，从而延长心肌细胞舒张期CaZ+瞬变，导致心肌舒张功能异常。陈颖等，通过转基因方法观察发现，转基因高表达SERCA2a可改善大鼠心肌梗死后1个月的心肌舒张功能，减少重构。在正常心脏，增加对心脏的刺激频率将提高心肌收缩力，这部分原因是由于SR中钙离了的净增加，这种变化在每次心搏中均发生周期性的变化。心力衰竭的特点是，随着心搏频率的增加，其收缩力反而降低，导致心肌收缩力贮备减低或缺乏，甚至产生逆转，从而导致负性力一频率关系。有学者认为，SERCA2a含量可直接影响CaZ+的储备量。由于心肌释放CaZ+是由其CaZ+储备量决定的，CaZ+储备量的减少直接导致SR的CaZ+释放量的减少。对衰竭心脏进行研究发现，SERCA2a转动钙离子的活性明显降低。本次实验证明，益母草生物碱能明显提高冠状动脉结扎模型大鼠左室收缩压以及左室内压最大上升速率，表明益母草生物碱在提高大鼠心肌收缩力方面有较好作用，这可能与益母草生物碱能够提高模型大鼠心肌组织SERCA2a含量有关。SERCA2a活性实验数据表明，益母草生物碱还能提高模型大鼠心肌组织SERCA2a活性。表明益母草生物碱在心肌肌浆网摄取CaZ+功能方面也有明显改善作用，这与益母草生物碱能降低模型大鼠左室舒张末压、提高左室内压最大下降速率是吻合的，说明益母草生物碱对心肌梗死大鼠心肌舒张功能也有改善作用。因此认为，益母草生物碱在改善收缩与心肌舒张功能方面均有作用。其提高SERCA2a含量及活性的分子机制还待进一步研究。

作者简介：姜水印(1964－)，男，毕业于上海中医药大学，副研究员，博士研究生，现工作于上海中医药大学(邮编：201203)；吕嵘、黄品贤，工作于上海中医药大学；刘春燕，工作于湖南中医药大学；卫洪昌(通讯作者)，工作于上海中医药大学(邮编：201203)。