猫爪草总皂苷对人肝癌HepG2细胞活性的影响

[摘要] 目的 观察猫爪草总皂苷体外对人肝癌HepG2细胞活性的影响。 方法 采用系统溶剂法提取猫爪草总皂苷，3H-TdR掺入法和集落形成实验观察猫爪草总皂苷对HepG2细胞增殖的影响。 结果 猫爪草总皂苷对HepG2细胞增殖和集落形成均有显著性的抑制作用，呈现较好的量效关系。 结论 猫爪草总皂苷能较好地抑制HepG2细胞增殖。

[关键词] 猫爪草总皂苷；人肝癌HepG2细胞；细胞增殖

[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）10-0003-03

中药猫爪草（Radix ranunculus ternati）系毛茛科植物小毛茛（Ranunculus Ternatus Thunb）的干燥块根，性温，味甘、辛，入肝、肺经，具有清热解毒、消肿散结、止咳祛痰等功效[1]。临床用于治疗肺结核、淋巴结核、咽喉炎、疟疾等症，对肺癌、肝癌、淋巴癌、甲状腺瘤、乳腺肿瘤等疾病已显示出较好的治疗效果[2，3]。皂苷类广泛存在于植物中，具有广泛的药理活性，包括抗肿瘤、抗炎、抗微生物、抗糖尿病、抗氧化、免疫促进以及心血管和神经保护作用等[4]。

猫爪草总皂苷对肉瘤S180、艾氏腹水瘤EAC、人乳腺癌细胞株MCF-7[5，6]以及人结肠癌LoVo细胞[7-9]的生长有显著性抑制作用。目前尚没有猫爪草皂苷对人肝癌细胞株作用研究的相关报道。本文对猫爪草总皂苷对体外培养的人肝癌HepG2细胞活性的影响进行了研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 猫爪草购自浙江省立同德医院中药房，经鉴定为毛茛科植物小毛茛的干燥块根。5-氟尿嘧啶（5-Fu）：天津金耀氨基酸有限公司，批号1105131。

1.1.2 细胞株 人肝癌HepG2细胞，中国科学院细胞库提供，本实验室液氮保存。

1.1.3 主要试剂 RPMI-1640（吉诺生物医药技术有限公司，批号20110720）；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所，批号110304）；0.25%胰蛋白酶（吉诺生物医药技术有限公司，批号11090901）；氚-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）（中国科学院上海应用物理研究所，浓度1 mci/mL，比度4ci/mM，批号100430）；二甲基亚砜（分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司，批号20110310）。石油醚、乙酸乙酯、正丁醇均为分析纯。

1.1.4 主要仪器 3165型CO2培养箱（美国Forma公司）；2050型液闪仪（Packard公司）；XS-24型细胞收集仪（浙江绍兴坡圹医疗器械厂）；GS-6R型离心机（Beckman 公司）；HR40-Ⅱ-A2型医用净化工作台（青岛海尔特种电器有限公司）；CK40-F200型倒置显微镜（日本Olympus公司）；细胞培养板（美国Costar公司）。

1.2 方法

1.2.1 猫爪草总皂苷的制备 猫爪草总皂苷的制备参照王爱武等的方法[5]。具体操作如下：称取干燥的猫爪草600 g，粉碎成粗颗粒，用6倍量85%乙醇加热回流提取3次，每次3 h，醇提液回收乙醇，用石油醚萃取3次，再以水饱和的正丁醇萃取3次，正丁醇萃取液用0.1 mol/L NaOH 萃取2次，正丁醇液回收，浓缩至浸膏，置真空干燥箱干燥至无溶剂残留，得总皂苷。实验前用RPMI-1640培养液溶解，过滤除菌，4℃冰箱内保存备用。

1.2.2 细胞形态学观察 倒置显微镜观察经猫爪草总皂苷作用后的细胞形态学改变。

1.2.3 3H-TdR掺入法观察猫爪草总皂苷对HepG2细胞增殖的影响 取对数生长期HepG2细胞配制成1×105/mL细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100 μL，培养24 h后，分别加入不同浓度的猫爪草总皂苷100 μL，使终浓度为6.25 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL，每一药物浓度做3个复孔，同时设25 μg/mL 的5-氟尿嘧啶（5-FU）对照和10%FCS的1640培养液对照，37℃、5%CO2培养箱培养48 h后分别加入含0.3 μci 3H-TdR的1640培养液50 μL，继续培养16 h，常规收集细胞，测定每个样品每分钟脉冲数（cpm），用三孔的平均cpm值计算出猫爪草总皂苷对HepG2细胞的抑制率。按下列公式计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率=（1-实验组平均cpm值/对照组平均cpm值）×100%。

1.2.4 集落形成实验 取对数生长期HepG2细胞以100个/mL浓度，每孔1 mL接种于24孔板中。37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后分别加入不同浓度的受试药物1 mL，同时设12.5 μg/mL的5-FU对照和10%FCS的1640培养液对照。37℃、5%CO2培养箱中静置10 d。弃去培养液，用瑞氏染液染色，肉眼计数细胞克隆数，结果以集落形成率（%）表示。集落形成率=集落数/接种细胞数×100%。

1.2.5 统计学分析 计量资料数据用x±s表示，两个样本均数比较采用t检验，多组间均数比较用Welch法和Brown-Forsythe法。所有数据均由SPSS 17.0统计软件进行处理，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态学观察

各处理组细胞经猫爪草总皂苷处理48 h后，镜下均可见有细胞由贴壁不同程度脱落，悬浮在培养液中。光镜下见细胞变圆，体积缩小，细胞质内可见较多颗粒、空泡颜色加深，呈深褐色，并出现片状无细胞生长区。对照组细胞呈多角形，贴壁生长，几乎无脱落，光镜下见细胞完整，胞质饱满，相邻细胞生长融合成片。见图1～2 。

2.2 3H-TdR掺入法观察猫爪草总皂苷对HepG2细胞增殖的影响

由表1可见，猫爪草总皂苷从12.5 μg/mL浓度开始，到200 μg/mL浓度处理48 h后对HepG2细胞均有一定的抑制作用，且呈量-效关系，以200 μg/mL皂苷抑制率为最高。皂苷处理组HepG2细胞生长抑制率与阴性对照组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。

2.3 集落形成试验

由表2可见，猫爪草总皂苷（12.5～200） μg/m；L浓度对HepG2细胞的集落形成均有不同程度的抑制作用，与阴性对照组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。

3 讨论

中草药抗肿瘤具有毒副作用小的特点，有必要不断从植物中寻找抗肿瘤药物及拓展现有抗肿瘤药物的利用范围。研究发现，猫爪草皂苷可抑制多个肿瘤细胞株的生长活性。王爱武等[5]研究发现，猫爪草总皂苷对肉瘤S180、艾氏腹水瘤EAC及人乳腺癌细胞株MCF-7的生长有显著抑制作用。尹春萍等[6]的研究也证明了猫爪草皂苷对人乳腺癌细胞株MCF-7的生长和集落形成有不同程度的抑制作用，他们还利用体内实验证明猫爪草皂苷通过提高小鼠免疫功能而发挥抗肿瘤效应。周清安等研究发现，猫爪草皂苷可能通过增加Ca2+浓度[7]，调控相关基因表达[8]，下调细胞线粒体膜电位[9]而明显抑制人结肠癌LoVo细胞增殖和诱导其凋亡。孟祥虎等[10]研究发现猫爪草皂苷可能是通过促进mfn2基因的表达而抑制MCF-7细胞增殖及诱导其凋亡。

肝癌是一种在我国发病率较高的恶性肿瘤，寻找针对肝癌化疗药物及辅助化疗药物已成为开发抗肿瘤药物的热点之一[11]。本研究通过倒置显微镜观察猫爪草总皂苷可引起人肝癌HepG2细胞形态和颜色的改变以及成片脱落。并且与阴性对照组比较，12.5 μg/mL浓度的猫爪草总皂苷即可对人肝癌HepG2细胞株的生长和集落形成有显著性抑制作用，随着浓度的升高抑制作用增强，并呈现良好的量效关系。说明猫爪草总皂苷可能是通过降低HepG2细胞株细胞的独立生存能力而抑制其生长的。具体作用机制还需要进一步研究。此外，皂苷类成分复杂，猫爪草总皂苷中对人肝癌HepG2细胞株起抑制作用的确切的有效成分，及其发挥作用的分子机制还有待进一步研究探索，从而为猫爪草的开发利用提供科学依据。

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[10] 孟祥虎，刘博，尹春萍，等. mfn2 基因在猫爪草皂苷，红三叶异黄酮治疗乳腺癌中的作用机制研究[J]. 中国药师，2011，14（9）：1243-1246.

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（收稿日期：2013-01-23）