时间：2022-05-08 09:38:06
摘 要：以猪气管软骨为原料，利用二次酶解法提取硫酸软骨素，设计正交试验对酶解工艺进行优化，并测定了硫酸软骨素的纯度、含氮量、含氯化物量等主要指标。结果表明：最佳工艺组合条件为温度40℃，酶质量分数1.5%，提取时间2.5h，在此条件下平均得率达到10.98%，纯度达到85.22%。该工艺简便易行，有望为工业生产提供参考。
关键词：猪气管；酶解；硫酸软骨素；工艺优化
Abstract： In this paper， the preparation of chondroitin sulfate （CS） by two-step enzymatic hydrolysis of swine trachea cartilage was optimized using orthogonal array design. The starting raw material was hydrolyzed sequentially by trypsin and a special-purpose enzyme preparation. The samples obtained were measured for purity and nitrogen and chloride contents. The optimal hydrolysis conditions were determined as 40 ℃， 1.5% of enzyme concentration and 2.5 h. Under these conditions， the average yield of CS was 10.98% and the purity was 85.22%. The optimized process is simple and easy to operate and can provide useful evidence for future industrial production.
Key words： swine trachea； enzymatic hydrolysis； chondroitin sulfate （CS）； process optimization
中国分类号：Q538 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）12-0001-04
硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS）是一种酸性黏多糖，广泛存在于哺乳动物的气管、喉骨、鼻骨、舌骨和腿骨。硫酸软骨素主要是由葡萄糖醛酸和氨基己糖交替连结而成的聚合物，通常为白色或微黄色粉末，具有很好的吸湿性，易溶于水而难溶于乙醇、丙酮等有机溶剂。硫酸软骨素具有降血脂、抗凝血和抗肿瘤等生理功效，临床上可用于预防动脉粥状硬化及舒缓关节炎等[1-5]。同时还作为食品添加剂，用于食品的乳化和去异味等。此外，还可调节皮肤的细胞代谢，促进吸收营养，保持皮肤的水分[6-8]。
目前国内外对硫酸软骨素的研究主要集中在提取和功能性检测方面。Garnjanagoonchorn等[9]通过对比鲨鱼肋骨、气管、舌骨和胸骨等不同部位的软骨素含量和软骨素种类，并进行红外检测，发现鲨鱼胸骨和舌骨是软骨素含量最高的软骨，得率达到11.55～14.84g/100g。Miguel等[10]通过采用酶解和碱性水醇水解复合法，经超滤后从背脊鳐中提取出高纯度的硫酸软骨素，纯度达到99%；Nakanoa等[11]通过采用各种酶对肉鸡中硫酸软骨素进行提取、分离和药用分析，发现胰酶是最佳的软骨素分解酶，其分解的软骨素和缩氨酸链与硫酸角质素的抗原性高于猕猴桃中风味蛋白酶的抗原性相比；丁璞等[12]对驴软骨中硫酸软骨素进行提取，确定了驴软骨硫酸软骨素提取最优化的工艺条件，得率达到10.53%。至今已上市的硫酸软骨素产品以胶囊、片剂和液体剂型存在，常与胶原蛋白、碳酸钙、葡萄糖胺等成分混合而成，可见硫酸软骨素的药用价值极高。目前对硫酸软骨素的提取方法有很多，主要包括中性盐法、碱提取法、稀碱浓盐提取法、酶提取法、超声波法和乙酸抽提法等。酶解法产率、纯度较高，生产周期较短，且对环境污染较小，是比较理想的制备方法[13-14]。同时选用猪气管与猪喉管、鼻骨软骨等相比，价格便宜。采用二次酶解法对猪气管中硫酸软骨素进行了提取研究，对企业资源进行整合利用再加工，提高其附加价值。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
猪鲜气管 湖北宝迪农业科技股份有限公司；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、软骨水解专用蛋白酶A4、2709碱性蛋白酶 南宁东恒华道生物科技有限责任公司；LKA98cl树脂 山东鲁抗立科药业有限公司；比浊用玻璃管 北京哲成科技有限公司；D-葡萄糖醛酸、咔唑、四硼酸钠 国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠、盐酸、氯化钠、乙醇、硫酸铁、硝酸银、硫氰酸氨、硫酸肼、乌洛托品均为分析纯。
1.2 仪器与设备
HH-4数显恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；FA1104电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司；JJ-1精密增力电动搅拌器 常州普天仪器制造有限公司；实验室pH计 梅特勒-托利多仪器有限公司；101型电热鼓风干燥机 北京中兴伟业仪器有限公司；U754可见分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司。
1.3 方法
1.3.1 软骨素提取流程
软骨预处理酶解灭酶吸附过滤树脂纯化醇沉脱水干燥软骨素样品
1.3.2 酶解条件筛选
通过单因素试验分析酶解种类及pH值、提取溶剂、酶解温度、酶解时间、酶质量分数等因素对硫酸软骨素的影响。酶解因素的条件：1）取一定量软骨于烧杯中，一定比例加入自来水，采用二次酶解法进行酶解，以胰蛋白酶和软骨素专用酶、胰性蛋白酶和木瓜蛋白酶、木瓜蛋白酶和软骨素专用酶进行试验，酶解温度50℃，酶解2h，pH值在各自适宜范围内，重复3次，取平均值；2）以一定比例加入：a.等量自来水，b.甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，c.缓冲液，d.硼酸-氯化钾缓冲液，e.硼砂-碳酸钠缓冲液，其他实验步骤同上；3）调节第一次酶解温度分别为30、35、40、45、50、55℃，其他实验步骤同上；4）调节第一次酶解的时间分别为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0h，其他实验步骤同上；5）调节第一次酶质量分数分别为0.5%、0.8%、1.1%、1.4%、1.7%、2.0%，其他实验步骤同上。
1.3.3 酶解最优工艺
1.3.4 硫酸软骨素指标测定
1.3.4.1 硫酸软骨素含量测定
硫酸软骨素得率/% = 硫酸软骨素粗品/软骨原料×100
硫酸软骨素纯度检测：采用稍加修饰的硫酸咔唑法[15-18]。
分别取配制好的D-葡萄糖醛酸标准溶液（质量浓度为0.1mg/mL）于10mL容量瓶内，用去离子水定容，得到质量浓度分别为10.0、20.0、30.0、40.0、50.0?g/mL和60.0?g/mL的D-葡萄糖醛酸标准溶液。然后将装有5.0mL硼砂-硫酸试剂的试管中，在冰浴条件下分别加入1.0mL不同质量浓度的D-葡萄糖醛酸标准溶液，同时用去离子水做空白对照，其间注意避免出现沸腾现象。沸水浴10min后迅速取出冷却至室温，加入0.2mL咔唑试剂，沸水浴后15min冷却至室温，在530nm处测定吸光度。根据吸光度（A）和D-葡萄糖醛酸质量浓度（C）绘制其标准曲线。
取一定量的硫酸软骨素样品，定容至10mL，按上述方法配成一定质量浓度，测定其吸光度，根据吸光度（A）和硫酸软骨素质量浓度（C）绘制其曲线。
1.3.4.2 其他指标的测定
水分、灰分、蛋白质、氯化物含量：分别按国家标准GB 500932010《食品中水分的测定》、GB 500942010《食品中灰分的测定》、GB 500952010《食品中蛋白质的测定》和SC/T 30112001《水产品中盐分的测定》进行检测；澄清度和pH值测定参照《中华人民共和国药典》2010年版二部；比浊度测定依据《中华人民共和国药典》2000年版二部[13，19-20]。
2 结果与分析
2.1 硫酸软骨素提取条件
2.1.1 酶种类选择及其pH值
从表3可以看出，通过比较硫酸软骨素得率，胰蛋白酶和软骨素专用酶的二次酶解法效果最好，软骨素平均得率达到9.26%，而胰蛋白酶最佳pH值为7.8～8.5，软骨素专用酶的最佳pH值为8.8～9.1，所以要尽可能维持酶解在最适pH值范围内。
3 结论与讨论
以1kg气管软骨为原料，按上述正交试验优化条件进行试验，重复进行3次，得到的硫酸软骨素的平均得率10.98%。
在猪气管软骨中，硫酸软骨素通过苷键与蛋白质等成分聚合在一起，在碱性条件下能破坏它们之间的苷键，而不会断裂硫酸软骨素分子上的硫酸基，从而改变软骨素分子大小和结构，保证了硫酸软骨素的活性并让其更好的释放出来。在生产硫酸软骨素过程中，若通过一次酶解，释放出的CS仍可能连接多个氨基酸残基或多肽，在后续纯化中很难除去。同时猪气管软骨中化学成分复杂，含糖原、脂肪等杂质，胰酶可将其水解成为醇溶性的小分子物质，有利于硫酸软骨素的分离提纯；软骨素专用酶是在碱性条件下通过?消除机理切断氨基己糖和L-艾杜糖醛酸残基之间的蛋白质肽键的一类特定分解蛋白酶。若蛋白质含量检测较高，可再利用三氯醋酸去除蛋白，这样可以增加硫酸软骨素的纯度。此外，由于树脂的使用次数会使得各批次样品颜色较黄，可采用双氧水进行后续的脱色处理[21-22]。
本实验首次通过采用胰蛋白酶和软骨素专用酶对提取液进行两步酶解，最终所得产品的纯度较高，各项指标均符合，达到软骨素出口标准。在酶解过程中采用缓冲液进行提取，维持反应液pH值，使得酶在最适宜的反应条件。可见，通过整合利用企业自身的资源，将副产品变废为宝，提高了其实用价值。
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