鞘内注射美洛昔康对神经损伤大鼠背根神经节内GAP―43和NGF表达影响

[摘要] 目的 研究鞘内注射美洛昔康（Mel）对CCI模型疼痛治疗效果和背根神经节（DRG）内生长相关蛋白-43（GAP-43）、神经生长因子（NGF）表达的影响。 方法 成年SD雄性大鼠随机分成四组：正常对照（C）组不做处理，CCI组不予注药，生理盐水（NS）治疗组予注射生理盐水，美洛昔康治疗（Mel）组予注射不同剂量美洛昔康（Mel组100μg，qd、Mel2组200μg，qd、Mel3组100μg，bid、Mel4组200μg，bid）；每（亚）组均为5只大鼠。35只大鼠分别于术前及术后3d、7d测试机械性缩足反射阈值（MWT）和热缩腿潜伏期（TWL）。术后7d取材大鼠DRG，检测其GAP-43、NGF表达水平。 结果 MWT、TWL方面CCI组、NS组和Mel组较正常组显著下降（P

[关键词] 神经性疼痛；鞘内给药；环氧化酶抑制剂；生长相关蛋白-43；神经生长因子

[中图分类号] R614 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）05-09-06

[Abstract] Objective To study the impact of intrathecal injection of meloxicam to the effect of CCI model on pain management and the expression of Growth-associated protein 43 and Nerve growth factor. Methods Adult SD male rats were randomly divided into four groups.Rats in control group were nothing，rats in CCI group were treated with no drug injection and normal saline，rats in treatment group were treated with saline injection，and rats in meloxicam group were treated with injection of different doses of meloxicam （100μg， qd in Mel1 group，200μg qd in Mel2 group，100μg， bid in Mel3 group，and 200μg， bid in Mel4 group）.5 rats were in each group.Mechanical withdrawal threshold （MWT） and Thermal withdrawal latency （TWL） of the 35 rats were determined before the operation and 3d，7d after the operation.DRG was selected on 7d after the operation to detect the expression level of GAP-43 and NGF. Results MWT and TWL in CCI group，MS group and Mel group were significantly decreased，compared with control group （PControl group （P

[Key words] Neuropathic pain；Intrathecal administration；Cyclooxygenase inhibitor；Growth-associated protein 43；Nerve growth factor

神病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是各种疾患引起的外周或中枢神经系统传导通路异常或功能障碍导致的痛敏症状，可出现于许多神经系统疾病中，影响到6%～8%的普通人群。NP对生活质量、情绪和睡眠的影响超过了其致病的病理负担[1]。由于其发病机制尚不明了，治疗效果不满意，目前多采用对症处理。研究[2-3]表明，环氧化酶（cyclooxygenase，COX）与神经性疼痛的发生密切相关，应用COX抑制剂治疗神经疼痛有一定效果。但全身用药带来的副作用却限制了其临床应用，而鞘内给药报道不多。GAP-43被认为是神经损伤生长发育和损伤再生分子标志，NGF表达与DRG出芽有关。二者被认为与神经损伤后神经性疼痛的发生相关[4]。为此，2016年5～10月本研究探讨鞘内注射（intrathecal injection，INTRA）选择性COX抑制剂美洛昔康对CCI疼痛模型的治疗效果，以及对GAP-43、NGF表达水平影响。进而探讨病理性神经疼痛的机制，以及预测COX抑制剂鞘内给药对疼痛治疗的可行性。

1 材料与方法

1.1 动物分组与鞘内给药

实验采用成年SD雄性大鼠（汕头大学医学院实验动物中心提供），体重200～260g。实验大鼠分为四组，分别为正常对照（C）组，CCI组，生理盐水（NS）治疗组和美洛昔康Mel（上海勃林格殷格翰药业有限公司，H20020217）治疗组，Mel组又根据给药剂量的不同分为四个亚组。首先，从INTRA成功大鼠中按随机数字法选出5只大鼠作为C组，之后将INTRA和CCI造模成功的大鼠按随机数字法分到其余各组中，每（亚）组均为5只。CCI组，行INTRA和CCI造模，但未予注药；NS组，行INTRA和CCI造模，术后6h开始每天鞘内注射生理盐水1次，容量为20μl；Mel组，行INTRA和CCI造模，术后6 h开始鞘内注射美洛昔康，注射的剂量分别为：Mel1组100μg，qd，Mel2组200μg，qd，Mel3组100μg，bid，Mel4组200μg，bid，直至术后第7d，鞘内注射的美洛昔康其容量均为20μL，再加NS 5μL冲管。

1.2 方法

1.2.1 鞘内给药模型的制作 选取PE-10导管（smiths medical公司，英国），本研究进行了部分改造。见图1。按照Strkson RV 报道的方法[5]进行选取腰段置管并加以改进，采用腰麻针引导。

1.2.2 利多卡因筛选实验 置管术3d后取运动功能正常的大鼠鞘内注射2%利多卡因（上海旭东海普药业，中国）20μL+NS 7μL，药物与NS间隔1μL气泡，确保全部注入蛛网膜下隙，如注药30s内出现双下肢瘫痪并在30min内恢复则表示鞘内置管模型成功。用于后续CCI造模实验。

1.2.3 大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤模型 参照Bennett和Xie1988年创建的方法[6]，在大鼠右侧臀肌间隙暴露坐骨神经主干部位，4-0的铬肠线结扎坐骨神经，结扎以引起大鼠腿部轻微抽搐而不影响神经外膜的血运为度，共打并列的结4个，结与结之间的间距大约为1mm，结扎完成后依次缝合肌肉和皮肤。左侧作为正常对照。术后6h，大鼠完全清醒的状态下，以Von Frey触针（stolting公司，美国）和BME-410C热痛刺激仪（中国医学科学院科学院生物工程研究所，中国）测试大鼠的机械性痛阈和热痛阈，选择机械性痛阈和热痛阈缩短的大鼠，即成功的CCI模型进入下一步的实验。

1.3 观察指标

1.3.1 机械性缩足反射阈值（MWT） 于筛网上用五块透明的有机玻璃板围成一个屋形空间，大鼠置于其中安静20min。使用Von Frey纤维丝垂直刺激大鼠右侧后肢足底中部，从2g开始，逐步增加，直至大鼠出现缩足反应后，记录阳性（X），阳性前最后一次阴性（O）触针开始，序贯测试三次，得到一系列数据，如OXOXOO，然后按照S.R. Chaplan等介绍的vonfrey使用方法[7]，查表得到系数k值，进行公式运算，得到50%缩足反射阈值。50%（g） threshold=[10（Xf+kδ）]/10000，Xf=最末次测试von Frey hair触针对应的对数值，在Vonfrey触针手柄上有标识；K值可根据撤足反应模式查表得出；δ=0.224。

1.3.2 热缩腿潜伏期（TWL） 用BME-410C型热痛刺激仪照射大鼠足底。照射开始至大鼠出现抬腿回避时间为热缩腿潜伏；切断时间为25s，以防止组织损伤。每只动物测定5次，剔除最小值和最大值，取剩余三数值的平均值，每次间隔3min。MWT和TWL分别于CCI术前、术后3d、术后7d测试。

1.3.3 标本取材、免疫组织化学 术后7d测试完，1%戊巴比妥麻醉后，取材大鼠L5、L6背根神经节，4%多聚甲醛固定12h，蜡块包埋，组织切片，片厚4μm。使用SP法检测背根神经节中的GAP-43和NGF的表达情况，主要步骤大致如下：（1）常规脱蜡至水；（2）高压抗原修复；（3）3%过氧化氢室温孵育；（4）滴加正常山羊血清封闭；（5）滴加兔抗GAP-43单克隆抗体（Abcam，公司，英国）或兔抗NGF多克隆抗体（Abcam公司，英国）孵育，4℃过夜；（6）PBS缓冲液洗，滴加生物素化的羊抗兔IgG；（7）滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液；（8）DAB显色试剂室温下显色，镜下控制反应时间；（9）苏木素轻度复染，脱水，透明，中性树脂封片；（10）阴性对照用PBS替代一抗行免疫组化染色。应用图像分析系统ImagePro-Plus6.0对免疫组化染色结果进行分析，在200倍镜下观察大体情况，然后在400倍光镜下观察并随机选取三个视野，运用ImagePro-Plus6.0测定每张图片的平均光密度值（IOD/area），即每个视野阳性染色区域总光密度与阳性染色区域的面积之比，取三个视野的平均值，应用平均光密度值来表示GAP-43和NGF表达水平的强弱，半定量分析和比较各组标本中GAP-43和NGF的表达水平。

1.4 统计学处理

使用ImagePro-Plus6.0图像软件分析免疫组化切片，以平均光密度值来表示GAP-43、NGF蛋白表达水平的高低。采用SPSS18.0统计软件进行统计分析，所有实验结果计量资料以（）表示，组间比较采用多样本均数单因素方差分析，组内比较采用t检验，P

2 结果

2.1 大鼠一般情况

所有入选大鼠实验中未出现死亡、伤口感染、脱管情况。坐骨神经结扎侧后肢出现不敢负重、跛行、甩腿、舔足现象，病侧后肢肌肉现萎缩。

2.2 大鼠机械性缩足反射阈值（MWT）、热缩腿潜伏期（TWL）变化

2.2.1 机械性缩足反射阈值（MWT） （1）g前MWT各组基础值差异无统计学意义（P>0.05），C组术前与术后差异无统计学意义（P>0.05）；术后MWT CCI组、NS组明显低于C组（P0.05）；（2）术后3dMWT值，与CCI组比较，Mel4组明显增加（P0.05）。（3）术后7d NS组和CCI组的MWT值，与Mel四个亚组差异均有统计学意义（P

2.2.2 热缩腿潜伏期（TWL） （1）术前TWL各组基础值差异无统计学意义（P>0.05），C组术前与术后差异无统计学意义（P>0.05）；TWL值术后CCI组、NS组明显低于C组（P0.05），Mel 2组、Mel3组无明显差（P>0.05）；（2）术后3dTWL值，Mel组与CCI组、NS相比明显增加（PMel1组，随给药剂量成倍增加TWL逐渐延长。见表2。

2.3 GAP-43蛋白表达变化

C组背根神经节内神经元细胞GAP-43表达最少，CCI组、NS组与C组差异无统计学意义（P>0.05）；Mel组与CCI组、NS组比差异有统计学意义（P0.05）。Mel治疗组，GAP-43表达量Mel1组>Mel3组>Mel2组>Mel4组，随给药剂量的成倍增加GAP-43的表达逐渐减少。Mel2组与Mel3组比差异无统计学意义（P>0.05），其余各组间比较差异均有统计学意义（P

2.4 NGF蛋白表达变化

C组背根神经节内神经元细胞NGF表达最少，Mel各亚组与CCI组、NS组比差异有统计学意义（P0.05）。NGF表达量Mel1组>Mel3组>Mel2组>Mel4组，随给药剂量的成倍增加NGF的表达逐渐减少。与Mel2组比，Mel3组、Mel4组差异无统计学意义（P>0.05），其余各组间比较差异均有统计学意义（P

3 讨论

前列腺素（prostaglandins，PGs）是动物和人体内的一类炎症、疼痛介质，环氧化酶（COX）是前列腺素合成的限速酶。研究表明，COX与神经性疼痛的发生密切相关，目前发现脊髓中的COX主要有三个亚型：COX-1、COX-2和COX-3 [2-3，8]。抑制环氧化酶的表达有助于改善神经性疼痛的痛敏状态，美洛昔康是选择性COX-2抑制剂，优先作用于COX-2，也作用与COX-1。脊髓中的COX-2可能在神经性疼痛的发生中起作用，而外周的COX-2可能在神经性疼痛的维持中起作用[3，9]。全身性使用COX-2抑制剂对神经性疼痛可以起到一定的治疗效果，但用药量大，加重了药物副作用出现，极大地限制了该类药物的应用。GAP-43蛋白是神经发育和发育的分子标志，NGF是神经修复、再生最具代表性的生长因子。众多研究表明二者与神经损伤引起的神经性疼痛相关[4，10-13]。

本实验通过鞘内给药模型、CCI疼痛模型组合，鞘内注射选择性COX-2抑制剂美洛昔康，直接作用于相应神经元脊髓节段，用药量小、针对性强。避免因全身用药量大才能达到效果的难题。使用Vonfrey触针、BME-410C热痛刺激仪对各组大鼠MWT、TWL进行测定观察，正常对照组术前术后变化，差异无统计学意义，CCI组、NS治疗组术后3d内MWT、TWL明显下降，之后至术后7d内相对稳定；美洛昔康治疗组MWT、TWL术后3d内也出现相应下降，但幅度相比CCI组、NS组小，随着实验进展，用药后MWT、TWL出现轻微回升，但不能达到完全缓解症状，术后7d改善效果依次为Mel4组>Mel2组>Mel3组>Mel1组。说明鞘内注射美洛昔康可以改善大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤的热痛敏、机械痛敏症状，缓解程度与给药剂量成一定的正相关性，再次验证了COX在神经性疼痛发生过程中的作用以及COX抑制剂在神经性疼痛中的治疗效果。Mel2组效果虽然与Mel3组差异无统计学意义，但其均值仍>Mel3组，可能提示鞘内单次大剂量用药效果优于多次小剂量用药，这尚须进一步实验去探讨；另一方面，美洛昔康剂量成倍增加并未带来治疗效果的成倍改善，提示鞘内用药可能存在最大效应剂量，即封顶剂量。环氧化酶作为炎症介质PGs产生过程中的限速酶，其作用机制涉及许多受体结合的限制[14]，组织部位不同所含受体量可能也不同，环氧化酶抑制剂的作用过程是否也涉及到受体量的限制，如果可能，是否可以通过对损伤处神经组织的受体进行粗定量，来作为我们治疗神经性疼痛局部用药量参照，那么就可以最大限度的避免全身性用药量大带来的负面影响，提高药效，精准治疗。

另外，使用Image Pro Plus6.0专业图像处理软件对免疫组化切片GAP-43、NGF蛋白表达水平进行半定量分析比较，正常对照组两种蛋白表达很低，CCI、NS组呈现高表达，美洛昔康治疗组中等表达；也验证了GAP-43、NGF在成熟组织中正常状态下低表达，而在神经损伤后才出现表达增加这一观点[10，15]，两者是参与神经修复关键成分。实验中可以看到，COX-2抑制剂美洛昔康越大，一定范围内带来的治疗效果越好，同时GAP-43、NGF蛋白表达却低。说明COX-2抑制剂美洛昔康可能参与了抑制了GAP-43、NGF的表达，其具体机制有待进一步探讨，目前相关文献较少。研究表明[16-19]，GAP-43、NGF作为神经修复的重要因子，在神经出芽、攀缘纤维、纤维再分布等过程中起到关键作用，并参与神经性疼痛的发生，这涉及神经系统的可塑性、神经胶质细胞的激活。尤其是NGF，作为第一个神经营养因子家族成员，可通过酪氨酸激酶受体TrkA和肿瘤坏死因子受体p75NTR两种膜受体介导引起一系列的生物效应，如诱导神经纤维生、参与炎症因子释放以及影响离子通道开放，敏化外周伤害性感受器，同时可使非选择性的配体门控阳离子通道阈值降低，导致痛觉神经元动作电位的阈值降低，从而介导疼痛信号的传导，导致病理性疼痛[20-23]。因此，把COX-2选择性抑制剂美洛昔康在本实验中治疗效果与二者蛋白表达情况进行联系，我们推测COX-2抑制剂对神经性疼痛的治疗机制是否涉及神经修复过程，COX-2抑制剂如何参与到了GAP-43、NGF表达，是否参与神经重塑、星形细胞活化等过程，有待以后实验进一步探究。目前国内有关鞘内给药环氧化酶抑制剂治疗疼痛的研究报道尚少。

综上所述，可见COX抑制剂美洛昔康对神经性疼痛的治疗效果是肯定的，而目前有关鞘内注射COX抑制剂治疗神经性疼痛的国内国外文献报道尚少，结合GAP-43、NGF指标的亦未多见，为此该项研究进行了尝试性探索。由于本实验观察时间为7d，鞘内长期给药COX抑制剂安全性暂不能下Y论，目前仅限于基础实验研究，但其作为一种特殊给药方式治疗神经疼痛，有着自身的优点，临床应用前景广阔，值得引起学者们关注。

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（收稿日期：2017-01-15）