HPLC法测定板栗顶芽内源激素含量研究

摘要：植物内源激素对于调控植物的生长发育、开花结实等生命活动至关重要，高效液相色谱法(HPLC)测定植物内源激素因其准确性而得到广泛应用。文章以板栗枝条顶端芽体为实验材料，通过实验总结出板栗内源激素的高效液相色谱测定方法的合适的实验条件、内源激素提取与纯化方法和色谱条件。

关键词：内源激素；高效液相色谱；板栗（Castanea mollissima Bl.）

中图分类号：S-3 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2011）-03-0076-1

植物的内源激素与植物生长发育的基本规律和代谢过程的调节控制都密切相关[1]。果树的许多生命活动过程都与激素息息相关，对激素的定性、定量研究是调控果树生长发育、开花结实的一种十分重要的途径和手段[2]，但是植物激素的含量很少，用传统的方法无法实现精确的研究，随着现代仪器的快速发展使我们对植物激素含量的定性、定量研究成为现实，尤其是色谱仪器的快速发展，几乎成为植物激素测定的必备设备，这为我们从宏观上用植物生长调节物质进行调控植物花芽分化、生长发育、开花结果、落叶休眠奠定了重要的基础[3]。

使用高效液相色谱法测定植物内源激素比较准确，在植物痕量测定方面起着重要作用[4]。用高效液相色谱法测定植物内源激素，提取方法和色谱条件是关键，通过反复实验，获得测定板栗（Castanea mollissima Bl.）枝条顶芽内源激素合适的实验条件、纯化方法和色谱条件。

1 采样方法

采用完全随机区组试验设计，三次重复，每株采八个不同方位枝条上的顶芽，每次50个，包入锡箔纸中，进行标记，放入液氮罐中，带回试验室，放入-60℃超低温冰箱中备用。

2 液相仪器分析条件

2.1 主要仪器和试剂

主要仪器：Agilent 1100型高效液相色谱仪。

主要试剂：色谱用甲醇、高纯水、0.1M冰醋酸和其他化学分析试剂。

2.2 色谱条件

色谱柱：Waters C18 3.9×150mm，4.5um；

流动相：甲醇：水：冰醋酸=46.0：53.5：0.5；

柱温：36℃；进样量：15uL；流速1.0mL/min；

标样：ZR、IAA、GA3、ABA均为Fluka产品。

采用外标峰面积定量方法，梯度洗脱，洗脱条件如表1：

表1IAA、GA3、ABA和ZR梯度洗脱条件

3 板栗顶芽内源激素提取纯化方法

首先，从超低温冰箱中取出样品，用精确度为0.1mg的化学分析天平迅速准确称取0.5g样品，在研钵中加入冰醋酸研磨直至成为浆状，研磨好的浆状物倒入准备好的小烧杯中，用甲醇冲洗研钵数遍，保证浆状物全部洗入烧杯中。研磨时注意避光，需要在研钵中加入少量抗氧化剂，用锡箔纸封住烧杯口，放入恒定3℃冰箱中浸提过夜。

其次，从冰箱中取出烧杯，加入不溶PVP(聚乙烯聚吡咯烷酮)，进行搅拌，大约8min左右，进行抽提、弃残渣、过滤，将过滤液倒入浓缩瓶中，加入几滴氨水，用旋转蒸发仪器进行浓缩（温度不要超过40℃，然后用试管定容在5ml，放入冰箱中冷冻过夜（温度在-18℃以下）。

再次，取出样品，放入离心机中进行离心，离心前用水配平，转速在4500转以上，离心15min左右，离心后取出试管，倒出上清液于烧杯中，调ph值大约为2.8左右，定容至10ml试管中，用等体积的乙酸乙酯萃取三次，取出上清液倒入浓缩瓶中，在38-40℃温度下用旋转蒸发仪浓缩至干。

第四，浓缩后的浓缩瓶用流动相溶液溶解，然后定容到1ml青霉素管中，放入高效液相仪器中测定样品中激素含量。

4 实验结果与讨论

在上述色谱条件和样品提取纯化方法下，样品中IAA、GA3、ABA、ZR激素可以获得比较好的分离效果，从图1中可以看出，基线比较平直，峰型好，拖尾少，能够获得比较好的色谱图；从图2中可以看出标样中GA3、IAA、ZR和ABA激素的峰高、峰型和保留时间，同图1中样品混合液中峰1、峰2、峰3和峰4比较符合，说明样品混合液中峰1、峰2、峰3和峰4分别是IAA、GA3、ABA和ZR，因此，本实验采用的色谱分离条件和样品提取纯化方法适用于板栗顶芽内源激素定量和定性测定。

注：1-GA3(赤霉素)；2-IAA（生长素）；3-ZR(玉米素)；4-ABA（脱落酸）。

参考文献

[1] 王沙生,高荣孚,吴贯明.植物生理学[M].北京:中国林业出版社,1991.

[2] 黄卫东.温带树花芽孕育激素调控的研究进展.园艺学进展.

1994,(2):37-45.

[3] 张立民.板栗花芽分化规律及其调控研究.北京林业大学硕士论文.2007,10-11.

[4] 河北农业大学.果树栽培学[M].北京:中国农业出版社,1987

(2).

作者简介：王春光（1971-），男，吉林永吉人，吉林省永吉县林业局一拉溪林业工作站助理工程师，研究方向：林业技术推广。