以沙门氏菌为载体的DNA疫苗对小鼠肿瘤的预防作用

【摘要】目的：探讨减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的DNA口服疫苗防治小鼠肿瘤的可行性。方法：通过电转化法将真核表达载体pCMVmIL-12、EGFPN1导入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261中，经由胃管饲于BALB/c和C57BL/6小鼠。6周后分别用4T1乳腺癌细胞和Lewis肺癌细胞进行攻击。通过流式细胞仪、共聚焦显微镜检测绿色荧光蛋白在小鼠各组织中的表达，通过PCR和ELISA的方法检测mIL-12基因的整合和表达情况。并考察肿瘤的受抑情况和小鼠的生存期。结果：在小鼠的肝、脾、小肠、肾脏和肿瘤中可检测到绿色荧光蛋白的表达和相应细胞因子基因的整合。血清中相应的细胞因子水平较对照组明显升高（P

【关键词】基因治疗；减毒沙门氏菌；鼠白细胞介素-12

文章编号：1009-5519（2007）13-1897-03中图分类号：R73文献标识码：A

肿瘤是造成人类死亡的第二大原因，而且在人群中的发病率日益增高。如何预防和治疗肿瘤是现代医学研究的热点和难点。以口服方式预防和治疗肿瘤是目前最简便、安全的理想途径。自70年代以来，减毒沙门氏菌的口服活菌苗已被广泛应用于预防人、兽、家禽的感染性疾病，取得了令人瞩目的成就[1]。目前以减毒沙门氏菌为载体的DNA疫苗已在小鼠体内进行了初步研究并取得了良好的效果[2]。本研究将绿色荧光蛋白基因（Green Fluorescence Protein，GFP）、小鼠的IL-12基因分别导入减毒沙门氏菌中，考察外源基因在体内的整合、表达情况及产生的效应，借以推测减毒沙门氏菌作为口服基因治疗载体的可行性，为肿瘤的预防和治疗探索一条简便、安全、有效的途径。

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1细胞株：C57BL/6小鼠Lewis肺癌细胞、BALB/c小鼠4T1乳腺癌细胞均由上海市第一人民医院惠赠。

1.1.2质粒与菌株：EGFPN1质粒由上海市第一人民医院惠赠，pCMVmIL-12由台湾中央研究院杨宁荪教授惠赠，减毒鼠伤寒沙门氏菌LB5000、SL3261由美国Stocker教授及何笑松博士惠赠，EcoliDH5α为本室保存菌株。

1.1.3试剂：细胞培养基RPMI1640购自GIBCO公司，小牛血清购自华美公司，Taq酶、dNTP均购自基因公司， mIFN-γ、mIL-12 ELISA试剂盒均为Endogen公司产品。

1.1.4引物合成：CMV启动子上游引物为：5'-CCCAGTACATGACCTTATGGG-3'，下游引物为5'-GGAGACTTGGAAATCCCCGT-3' [3]，在上海生工合成。

1.1.5实验动物：BALB/c、C57BL/6小鼠购自中科院上海动物所，4~6周，雌性。

1.2实验方法

1.2.1携带目的基因的减毒沙门氏菌的制备：应用电转化法将EGFPN1和pCMVmIL-12的质粒分别导入感受态沙门氏菌LB5000中，提取在LB5000中经修饰过的质粒再经电转化导入SL3261感受态细菌中。电转化条件：2000V电压、25 μF电容、200 Ω电阻、放电时间为4毫秒。

1.2.2小鼠的口服免疫：小鼠共分6组，每组10只。其中BALB/c和C57BL/6各3组，分别是空白对照组（Blank）、GFP、mIL-12、将EGFPN1/SL3261、pCMV pCMVmIL-12/SL3261分别接种于2 ml含相应抗生素的LB培养液中，振荡过夜，次日取50 μl加入50 ml含相应抗生素的LB培养液中，2小时后收集菌体，PBS清洗后，用10％碳酸氢钠悬浮，调整细菌数为1×109/ml，各实验组鼠用胃管饲服相应细菌0.1 ml，Blank组饲服等量10％碳酸氢钠溶液。2周1次，共服3次。

1.2.3小鼠血清的收集：每只小鼠口服免疫前眼球采血1次，此后每2周眼球采血1次，收集于0.5mlEppendorf管中，约0.1 ml。置4℃冰箱12小时后，2×103转/分离心收集上清液，标记好组别、日期，置-20℃保存。

1.2.4肿瘤接种：4T1和Lewis细胞用0.25％胰酶消化后，调整至1×107/ml。BALB/c小鼠接种4×105个4T1细胞，C57BL/6小鼠接种1×106个Lewis细胞。

1.2.5绿色荧光蛋白在小鼠脾细胞中的表达：口服免疫4周后，GFP组与Blank组各取5只小鼠放血处死，剖开腹腔取脾脏，PBS清洗3次，400目钢网上研磨成单细胞悬液，0.85％氯化胺溶解红细胞后用PBS将脾细胞调成1×107/ml，用流式细胞仪检测。

1.2.6冰冻切片的制备：口服免疫4周及接种肿瘤2周后，每组小鼠各取1只。眼球放血处死，剖开腹腔取出肝脏、脾脏、肾脏和小肠，置于10％甲醛中固定48小时，再放入20%蔗糖溶液中处理12小时。进行冰冻切片，切片厚度12 μm。置于共聚焦显微镜下观察。

1.2.7真核表达载体的PCR检测：小鼠接种肿瘤2周后，每组各取1只，眼球放血处死、剖开腹腔取肝脏、脾脏、肾脏和小肠，用PBS清洗后，常规方法提取基因组DNA进行PCR反应，反应条件：94℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃延长45秒，共进行30个循环，72℃延长10分钟，9％聚丙烯凝胶电泳检测。

1.2.8淋巴细胞亚群分析：口服免疫6周后，每组小鼠各取5只眼球采血，用肝素抗凝。取20 μl抗凝血，加入20 μl anti-CD3及anti-CD4（或anti-CD8）荧光抗体，作用15分钟后加入200μl红细胞裂解液，5分钟后加入1 ml PBS，3 000 r/min离心10分钟，沉淀用400 μl PBS重悬后在Facscalibar流式细胞仪（Becton Dickinson Inc.）上进行CD3+、CD4+、T和CD3+、CD8+、T细胞计数。

1.2.9细胞因子的ELISA检测：参照说明书进行。每份血清做3个复孔。

1.2.10统计学分析：各组资料先经正态分布检验和方差齐性检验后再做方差分析，α=0.05，P

2结果

2.1绿色荧光蛋白在小鼠脾细胞中的表达：见表1。

注：与各自的对照组比较，P

2.2绿色荧光蛋白在小鼠组织中的表达：在BALB/GFP组、C57BL/GFP组小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、小肠和肿瘤中均可检测到绿色荧光蛋白的表达，其中以脾脏（见图1）的表达较强，未见明显的肿瘤靶向性。在其余各组小鼠的组织中未能检测到绿色荧光蛋白的表达。

2.3基因组中真核表达载体的检测：鉴于真核表达载体EGFPN1、pCMVmIL-12，均以CMV为启动子，故以PCR检测染色体中有无CMV片段作为目的基因有无整合入基因组的证据。结果显示除Blank组外，各实验组小鼠的肝、脾、小肠、肾脏、肿瘤组织中均可扩增出一个141bp大小的片段，与引物设计时所预计的扩增片段大小相符。表示沙门氏菌可将外源基因整合入小鼠各组织器官中（见图2）。

图2基因组DNA的PCR产物

2.4淋巴细胞亚群分析：口服免疫6周后作CD3+、CD4+、CD3+、CD8+淋巴细胞亚群分析。BALB/c小鼠各组的实验结果显示细胞因子治疗组CD8/CD4明显高于Blank组和GFP组（P

注：*与空白对照组相比P

C57BL/6小鼠的实验结果与表2相似，细胞因子治疗组CD8/CD4明显高于Blank组和GFP组（见表3）。

注：*与空白对照组相比P

2.5存活率的比较

2.5.1BALB/c小鼠存活率的比较：BALB/c小鼠各处理组未见肿瘤完全消退者，但细胞因子处理组的生存期较GFP与Blank组均有显著增长(P

图3BALB/c小鼠的各组存活率

2.5.2C57BL/6小鼠存活率的比较：各处理组存活时间明显延长 (P

图4C57BL/6小鼠的各组生存率

2.6血清中mIL-12含量的检测：见图5、6。

图6C57BL/6各组小鼠血清中mIL-12的含量

2.7血清中mIFN-γ含量的检测：见图7、8。

3讨论

IL-12是异源双链糖蛋白，在调节机体免疫功能方面起着十分重要的作用，是连接先天性免疫与适应性免疫的桥梁。IL-12可诱导活化的T细胞和NK细胞增殖，CD8+T细胞分化，激活T细胞、NK细胞和肥大细胞产生IFN-γ，诱导Th1细胞免疫应答，抑制T淋巴细胞向Th2细胞分化。IL-12还调节多种细胞因子的生成，刺激造血干细胞增殖分化[4]。从PCR、流式细胞仪检测以及共聚焦显微镜的观察结果来看，减毒沙门氏菌确实可以将外源基因携带进入小鼠体内，并进一步在组织细胞的基因组中整合和表达。国外有文献报道沙门氏菌存在明显的肿瘤靶向性，它在肿瘤组织中与正常组织中浓集的比率约1000∶1，且将此种沙门氏菌饲于荷瘤小鼠可导致肿瘤生长受抑[5]。而本实验在小鼠的肝脏、脾脏、肿瘤、小肠、肾脏中均可检测到外源基因的整合和表达，从共聚焦显微镜直观的结果来看，脾脏与肿瘤中表达较强，没有明显的肿瘤靶向性。单独使用沙门氏菌抑瘤效果不明显。

小鼠血清中hIL-12和mIFN-γ的含量在相应的处理组中均有显著升高，进一步验证减毒沙门氏菌可将外源基因携带入小鼠组织细胞内，并进行有效表达。以减毒沙门氏菌为载体的口服基因治疗，通过口服途径使外源基因得以在体细胞中整合和表达，使外源基因（细胞因子）的分泌受机体自身免疫机制的调控，避免了全身用药所带来的不良反应，同时也省去了体外长期培养细胞和基因转染的繁杂程序，具有以往的治疗手段难以媲美的安全性和简便性。

本实验结果证明：减毒沙门氏菌可作为口服基因治疗的载体发挥良好作用。但其转染效率较低，肿瘤靶向性不强，这两方面的缺憾有待进一步完善。

参考文献：

[1]Medina E，Paglia P，Nikolaus T，et al. Pathogenicity Island 2 Mutants of Salmonella typhimurium are efficient carriers for heterologous antigens and enable modulation of immune responses[J]. Infect Im-munity，1999，67:1093.

[2]Urashima M，Suzuki H，Yuza Y，et al.An oral CD40 ligand gene therapy against lymphoma using attenuated Salmonella typhimurium[J]. Blood，2000，95(4)：1258.

[3]During MJ，Symes CW，Lawlor PA，et al. An oral vaccine against NMDAR1 with efficacy in Experimental Stoke and Epilepsy[J]. Sci-ence，2000，287:1453.

[4]Gambotto A，Tuting T，Mcvey DL，et al. Induction of antitumor im-munity by direct intratumoral injection of a recombinant adenovirus vector expressing interleukin-12[J]. Cancer Gene Therapy，1999，6:45.

[5]Low KB，Ittensohn M，Trung L，et al. Lipid A mutant Salmonella with suppressed virulence and TNFα induction retain tumor-targeting in vivo[J]. Nature biotech，1999，17:37.

收稿日期：2006-11-21

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