酵母基因组及其线粒体基因组提取方法的比较

摘要：通过比较多形汉逊酵母基因组及其线粒体基因组的提取方法，获得一种简便、快速、高效、合适、成本低的提取方法。本文以多形汉逊酵母为研究对象，分别采用试剂盒法、酶解法和LiOAC/SDS/玻璃珠组合法提取多形汉逊酵母基因组及其线粒体基因组DNA，进而运用核酸凝胶电泳、紫外分光光度计测定DNA浓度及其纯度。结果表明：LiOAC/SDS/玻璃珠组合法具有DNA提取量大、成本低、浓度高；试剂盒法提取DNA纯度较高、质量较好，但是存在提取量小，浓度较低，成本较高等缺点；酶解法浓度一般，纯度差，成本高等缺点。

关键词：酵母 线粒体基因组 纯度

中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）10-0089-03

随着高通量测序技术的快速发展和测序成本的下降，人们已逐步深入到组学的研究水平。其中，由于酵母菌是一类单细胞真核微生物，具有结构简单、易于培养、生长迅速、遗传背景清晰，而且易于接受外源基因，被广泛作为模式生物或细胞工厂，应用于基础研究和应用研究中。这就需要对酵母菌进行基因组DNA分离提取，而基因组DNA的质量是影响高通量测序或分析细胞工厂的重要因素。但是，酵母菌的细胞壁比较厚实，重量约占其干重的30%，结构比较坚韧。细胞壁主要由三层构成，外层以α-1，6糖苷键为骨架和相关支链结合而成的甘露聚糖，内层以β-1，6糖苷键和相关支链结合成的葡聚糖，中间层为丰富的蛋白质分子。如何有效地破坏坚韧厚实的细胞壁是高效提取基因组DNA的重要前提，因而选择一种快速、高效、便捷、经济的提取方法尤为重要。

已有文献报道了液氮研磨法[1]、超声法[2]、复合酶法[3]、高压匀浆法[4]等酵母基因组提取方法。上述方法均存在一定的缺点，其中液氮研磨法需要反复冻融，操作过程较复杂，致使基因组DNA损失较多；超声法对细胞壁的破壁效果较差，基因组DNA得率较低；酶解法和高压匀浆法存在成本高，一次提取量较少，不适宜大量基因组DNA的提取。本实验通过对试剂盒法、酶解法、自行设计的LiOAC/SDS/酸洗玻璃珠法进行比较，获得一种简便、成本低、高效的基因组和线粒体基因组DNA的提取方法，为其相关组学研究提供前提条件。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

多形汉逊酵母（H.polymorpha）DL-1菌株（ATCC No.26012）；

YPD固体培养基（g/L）：葡萄糖20g；蛋白胨20g；酵母膏10g；琼脂粉15g，pH6.5，121℃灭菌20min；

种子液培养基（g/L）：葡萄糖20g；蛋白胨20g；酵母膏10g，pH6.5，121℃灭菌20min；

发酵液培养基（g/L）：丙三醇15g，（NH4）2SO4 15g，K2HPO4 0.24g，MgSO4・7H2O1.8g，CaCl2 0.28g，NaCl 0.6g，NaNo3 0.58g，FeCl3SO4・6H2O 0.006g，硫胺素盐酸盐0.004g，微量元素母液1ml。

微量元素母液（mg/L）：Na2MoO4・2H2O 484mg，MnSO4・H2O 176mg，KI 207.5mg，CuSO4・5H2O 40mg，ZnSO4・7H2O 40mg，pH为6.5。

酵母浸粉、蛋白胨、琼脂粉、醋酸锂、葡萄糖、氯化钠、氯仿、乙醇等分析试剂购自天津市科密欧化学试剂有限公司；琼脂糖、Tris-Hcl、十二烷基硫酸钠（SDS）、EDTA 、DNeasy Plant Mini Kit、Tris饱和酚等试剂购自美国Sigma公司。

台式冷冻离心机（美国Sigma公司）、漩涡混合仪（美国LABNET）、Bio-Rad SmartspecTMplus分光光度计、Bio-Rad DNA电泳仪、凝胶成像分析系统（美国Alpha-2200），超净工作台、高压灭菌锅、恒温摇床（上海智城分析仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 酵母基因组的提取

（1）改良DNeasy Plant Mini Kit试剂盒法。取酵母悬浮液1.5mL，8000r/min离心10min，弃去上清液后，加入100μL酸洗玻璃珠（直径0.5mm）和100uL细胞裂解液混匀后，置于漩涡振荡器上振荡10min后，离心8000r/min离心10min。将上清液转移到另一EP管中，加入2μL RNaseA和200uL BufferAP1混匀后，放入70℃水浴锅中孵育20min，期间上下摇匀3-4次后加入65uL Buffer P3混匀。然后放入-20℃冰箱中静置30min后，4℃条件下12000r/min离心10min。将上清液转移至QIA shredder spin柱子中，12，000r/min离心3min。将离心所得液体转移至EP管中，加入1.5倍体积的Buffer AW1，混匀备用。吸取300μl混合液至DNeasy Mini spin柱子中，10000r/min离心1min。将柱子放入新的收集管中，加入250μL Buffer AW2，10000r/min离心1min弃去滤过液。再加入250μL Buffer AW2，14000rpm离心2min。将柱子放入新的EP管中，加入20μL Buffer AE，室温静置10min，速度10000rpm离心1min，重复三次。将沉淀溶解在30μLTE中，-20℃下保存。

（2）LiOAC/SDS/玻璃珠组合法。取1.5mL酵母悬浮液，8000r/min离心10min 收集菌体；用无菌水清洗2次，弃去上清液后加入600μL破壁缓冲液（200mM/L LiOAC/1% SDS）和40μL酸洗玻璃珠（直径0.5mm），漩涡混合器上振荡30min，使菌体与破壁缓冲液混合均匀后，再放入70℃水浴锅中温育20min后1000r/min离心10min。将上清液转移到干净的离心管中，加等体积的预冷乙醇，充分混匀，14000 r/min离心10min，将沉淀用70%的酒精洗涤两次后风干后，溶于30μLTE缓冲液中，-20℃下保存。

（3）蜗牛酶过夜处理法。取1.5mL菌悬液8000r/min离心10min收集菌体，用无菌水洗涤2次，加入600μL裂解液，35μL蜗牛酶，37℃过夜处理；加入150μL氯仿-异戊醇（v/v24：1），450μL饱和酚，轻轻颠倒2次，混和均匀后静置10min，3000r/min离心10min；取上清液，用氯仿-异戊醇450μL（v/v24：1）抽提1次，10000r/min离心5min；取上清液加入预冷乙醇800μL，-20℃静置30min；14000r/min离心10min，沉淀物用70%乙醇洗两次，自然干燥后溶于30μLTE缓冲液；加入0.5μLRNaseA（10mg/mL）， 37℃温浴30min，自然冷却后-20℃保存。

1.2.2 酵母线粒体基因组的提取

（1）线粒体基因组提取前处理。取在YPD培养液中生长18h的酵母菌悬液15mL，8000r/min，4℃，离心10min，弃去上清液，加入5mL的GENMED清理液（Reagent A），摇匀。4000r/min，4℃，离心10 min。吸去上清液，向沉淀中加入1mL GENMED平衡液（Reagent B），摇匀。4000r/min，4℃，离心10 min。弃去上清液，再加入0.4mL GENMED平衡液（Reagent B），摇匀，加入10ul GENMED酶解液1（Reagent C），混匀。30℃恒温水浴锅内孵育60min（每隔15 min轻轻摇匀一次）。加入1mL GENMED平衡液（Reagent B），混匀，3000r/min，4℃，离心10min，重复两次。小心吸弃上清液，加入1 mLGENMED裂解液（含有GENMED裂解液（Reagent D）和GENMED净化液（Reagent E）），涡旋震荡5s，充分混匀细胞颗粒群，备用。

（2）线粒体DNA的提取。分别采用试剂盒法、LiOAC/SDS/玻璃珠组合法和酶解法对上述细胞颗粒群进行破壁处理，在处理过程中，破膜时间均为酵母菌破壁时间的1/2，其余操作方法不变。分离纯化获得DNA。

1.2.3 三种方法提取酵母基因组以及线粒体基因组的提取效果比较

用分光光度计和凝胶电泳仪进行测量比较。电泳条件：1%琼脂糖凝胶，每加样孔上样量都是3μL，100V恒压电泳30min，然后用Bio-Rad凝胶成像仪成像。

2 结果与分析

2.1 分光光度计法对酵母基因组的浓度与纯度检测

利用分光光度计对上述方法提取的酵母基因组浓度和纯度进行比较，结果如表1所示：试剂盒法提取的酵母基因组的浓度低、纯度高，但提取量小、成本高，对DNA纯度要求特别高的试验我们可以采取此方法；LiOAC/SDS/玻璃珠法的浓度最高、纯度较高、提取量大、成本低，对用量大，纯度要求不高的可以采用此方法；酶解法的浓度一般、纯度差、操作复杂、成本高，一般与其他方法结合使用。试剂盒法和酶解法中影响提取的结果主要原因是，试剂盒法对酵母细胞壁破壁不充分，除去蛋白质和金属离子过程中对DNA损失较大；酶解法对酵母细胞壁的破坏效果较彻底，导致碎片在沉淀过程中与DNA、蛋白质大量聚合，在洗脱过程中不易洗脱，损失较多，且残留了大量蛋白质。

2.2 分光光度计法对线粒体DNA浓度与纯度的检测

利用分光光度计对线粒体DNA进行检测，结果如表2所示，试剂盒法提取的DNA纯度高、浓度低；LiOAC/SDS/玻璃珠组合法获得的DNA纯度较高，浓度也特别高；酶解法提取的DNA纯度低，浓度一般。原因：试剂盒法主要由于在破壁过程中，破壁不充分，基因组不能够完全释放；酶解法主要原因是由于酵母细胞壁碎片、蛋白质等与DNA一起聚沉，以及酶处理过程中DNA酶对DNA的降解；LiOAC/SDS/玻璃珠组合法对细胞壁破壁较彻底，DNA提取较完全。

2.3 琼脂糖凝胶电泳法[5]

通过琼脂糖凝胶电泳对各种方法提取的酵母基因组DNA（gDNA）及其线粒体DNA（mtDNA）浓度进行再次验证，结果如图3和图4所示，酵母基因组DNA提取结果：试剂盒法提取的基因组DNA纯度高（无拖尾），浓度低（亮度暗），如图3泳道1-2所示；酶解法提取的酵母gDNA纯度低（有拖尾），浓度低（亮度较暗）（图3泳道3-4）；LiOAC/SDS/玻璃珠组合法提取的gDNA纯度较高，浓度高（亮度最亮），（图3泳道5-6）。酵母mtDNA提取结果：酶解法提取的mtDNA纯度低（前后均有拖尾），浓度一般（亮度一般）（图4泳道1）；试剂盒法提取的mtDNA纯度高，浓度低（亮度暗），（图4泳道2）；LiOAC/SDS/玻璃珠组合法提取的mtDNA纯度较高，浓度高（亮度最亮），（图4泳道3）。验证结果与分光光度计检测结果一致。

3 结语

本实验通过对试剂盒法、LiOAC/SDS/酸洗玻璃珠组合法、蜗牛酶法提取酵母菌基因组及其线粒体基因组的操作过程以及提取物浓度、纯度进行综合比较。认为，传统试剂盒法对酵母细胞破壁，其操作过程比较繁琐，每次提取量较少浓度较低而且价格比较昂贵，不适合大批量提取；蜗牛酶解法破壁，一般要求过夜处理，耗时过长，又由于蜗牛酶是复合酶，受环境影响较大，效率不稳定，消化能力较差，导致DNA杂质较多，分离纯化难度较大，最终获得DNA纯度较低，稳定性较差，不利于长期保存，而且试验成本也比较高；本实验提供的LiOAC/SDS/酸洗玻璃珠组合法提取的酵母基因组DNA浓度最高，纯度较好，操作过程简便、经济、快捷、适合大批量提取，等。

通过比较还可以发现：试剂盒法、LiOAC/SDS/酸洗玻璃珠组合法、蜗牛酶法对线粒体DNA的提取效果与对酵母基因组DNA的提取效果一致，其中试剂盒法纯度高、浓度低；LiOAC/SDS/酸洗玻璃珠组合法纯度较高，浓度特高；酶解法纯度差，浓度一般）。LiOAC/SDS/酸洗玻璃珠组合法不仅适用于酵母基因组的提取，而且对线粒体基因组DNA的提取也同样具有良好的效果。因此，本实验提供的LiOAC/SDS/酸洗玻璃珠组合法提取酵母基因组DNA和线粒体基因组DNA的方法是一种简便、快捷、高效、经济的提取方法。

参考文献

[1]Lakay F M，Botha A，Prior B A. Comparative analysis of environmental DNA extraction and purification methods from different humic acid-rich soils[J].J.Appl.Microbiol，2007，102（1）：265-273.

[2]Koek A，，Komori M，Veenhuis M，et al.A comparative study of peroxisomal structures in Hansenula polymorpha pex mutants[J].FEMS Yeast Res.2007，7（7）：1126 -1133.

[3]邢福国，张培军，谭训刚，等.酵母基因组的提取[J].食品科学，2007，28（3）：210-212.

[4]刘晓志，高健，韩柱，等.大量Pichia pastoris 酵母基因组DNA 的提取[J].生物技术通报，2011，4：167-170.

[5]唐巧玲，付鹏飞，王旭静，王志兴.一种简便高效的酵母基因组提取方法[J].生物技术进展， 2012，24：293 -296.

[6]唐天乐，高炳淼，长孙东亭，等.高质量毕赤酵母基因组DNA 提取方法比较[J].生物技术通报，2010，4（1）：196-199.

[7]赵宏宇，李，赵，等.4种酵母基因组提取方法的比较[J].食品科学，2011，32（9）：170-173.

[8]刘沐桑，郑楠，张原，刘维达.真菌线粒体基因组计划的研究进展[J].国际皮肤性病学杂志，2012，38（5）：347-349.

[9]夏玉玲，刘彦群，鲁成.动物线粒体DNA提取的原理和方法[J].蚕学通讯，2002，9（22）：24-29.

[10]Lorenz T C，Anand V C，Payne G S.High-throughput protein extraction and immunoblotting analysis in Saccharomyces cerevisiae[J].Methods Mol.Biol，2008，457：13-27.