丹参脂溶性及水溶性成分集成提取工艺研究

【摘要】 目的 优选丹参脂溶性及水溶性成分的集成提取工艺条件。方法 采用正交设计法,以丹酚酸B、丹参酮ⅡA为测定指标,采用高效液相色谱法测定其含量,并以此为指标优选集成提取工艺条件。结果 集成法可同时对丹参中脂溶性及水溶性成分进行提取。优选的提取工艺条件为:加8倍量70%乙醇,提取2次,每次1 h。结论 采用集成方法同时提取丹参水溶性及脂溶性部位,可省时、省工、节能,使丹参的提取工艺合理可行。

【关键词】 丹参;提取工艺;正交试验;丹酚酸B;丹参酮ⅡA

丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎,主要含有二萜醌类脂溶性及酚酸类水溶性成分。2005年版《中华人民共和国药典》(一部)以丹参酮ⅡA和丹酚酸B为指标[1],对丹参药材进行质量控制。为了能同时兼顾丹参脂溶性及水溶性两类有效成分,我们采用正交试验法,以丹参酮ⅡA和丹酚酸B的含量为考察指标,对丹参的提取工艺进行全面优选,以使丹参的提取工艺更科学、合理。

1 仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪。丹参酮ⅡA(批号110766- 200518)、丹酚酸B(批号111562-200605)标准品购自中国药品生物制品检定所;丹参药材购自安国药材市场(经河北省药品检验所中药室孙宝惠主任药师鉴定为正品)。甲醇、乙腈为色谱纯;其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 丹参提取液中丹参酮ⅡA的含量测定方法

采用Phenomenex Luna C18色谱柱(5 μm,250 mm×4.6 mm,广州菲罗门科学仪器有限公司),流动相:甲醇-水(75∶25),流速:1.0 mL/min,检测波长:270 nm。精密称取丹参酮ⅡA对照品10.21 mg,置50 mL棕色量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀;精密量取2 mL,置25 mL棕色量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,作为对照品溶液(每1 mL中含丹参酮ⅡA 16.32 μg)。分别取溶剂考察、粒度考察、正交试验及验证试验中回流提取液的稀释液,以0.45 μm微孔滤膜滤过,作为供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL,注入液相色谱仪,测定回流液中丹参酮ⅡA的含量。

2.2 丹参提取液中丹酚酸B的含量测定方法

采用Phenomenex Luna C18色谱柱(5 μm,250 mm×4.6 mm);流动相:甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59);流速:1.0 mL/min;检测波长:286 nm。精密称取丹酚酸B 8.20 mg至10 mL棕色容量瓶中,加75%甲醇至刻度,摇匀,再精密吸取2 mL至10 mL容量瓶中,以75%甲醇定容至刻度,摇匀,得164.0 μg/mL的丹酚酸B标准品溶液。分别吸取溶剂考察、粒度考察、正交试验及验证试验中回流提取液的稀释液10 mL至25 mL的棕色容量瓶中,以相应溶剂稀释至刻度,摇匀,以0.45 μm微孔滤膜滤过,作为供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5 μL,注入液相色谱仪,测定回流液中丹酚酸B的含量。

2.3 提取溶剂的选择

丹参脂溶性成分易溶于高浓度乙醇,但在预试验中,丹酚酸B在醇提时亦有相当部分被提取出来,所以考虑采用脂溶性部位与水溶性部位进行集成提取,以丹参酮ⅡA、丹酚酸B为含量测定指标,考察乙醇浓度对丹参脂溶性成分及水溶性成分提取率的影响。

称取丹参药材8份,每份30.0 g,平行2组,分别以8倍量水及10%、30%、50%、60%、70%、90%及95%乙醇回流提取2次,每次1.5 h,药液过滤,合并,放置室温,定容至1 000 mL。将以上药液取适量,按照上述含量测定方法测定丹参药材及各提取方法样品中丹参酮ⅡA及丹酚酸B的含量,并计算提取率。结果见表1。表1 丹参集成提取工艺溶剂的选择(略)

表1显示,90%乙醇提取时丹参酮ⅡA的提取率最高,为81.6%,但丹酚酸B提取率仅为48.3%;50%乙醇提取时,丹酚酸B提取率最高为75.1%,但丹参酮ⅡA的提取率仅为40.1%;70%乙醇提取时丹参酮ⅡA的提取率为80.7%,丹酚酸B提取率为73.2%。为兼顾二者,我们初步选择70%乙醇进行提取。

为验证高浓度乙醇提取后药渣中丹酚酸B的含量,取70%、90%、95%乙醇提取后的药渣再加8倍量的水回流提取2次,每次1 h,药液过滤,合并,放置室温,定容至1 000 mL。样品液处理后以HPLC法进行测定。结果表明:70%、90%及95%乙醇提取再水提的丹酚酸B的提取率分别为2.7%、18.4%及36.4%,均较低。由此可看出,醇提后再水提的工艺条件不合理,其原因可能是丹酚酸B长时间受热,导致分解,使提取率降低,因此,确定采用70%乙醇进行集成提取的工艺条件可行。

2.4 药材粉碎粒度的考察

称取丹参药材饮片、最粗粉及粗粉各30.0 g,平行2组,分别以8倍量70%乙醇回流提取2次,每次1.5 h,药液过滤,合并,放置室温,定容至1 000 mL,摇匀,取适量以0.45 μm微孔滤膜过滤,以HPLC法测定丹参酮ⅡA、丹酚酸B的提取率。结果见表2。表2 丹参醇提工艺药材粉碎的粒度选择(略)

表2显示,饮片及粗粉提取时丹参酮ⅡA的提取率均较最粗粉高,但饮片及粗粉提取时丹参酮ⅡA的提取率在同一水平;饮片、最粗粉及粗粉提取时丹酚酸B提取率分别为77.2%、80.5%、78.3%,三者在同一水平。从工业生产成本角度考虑,选择饮片直接提取即可。

2.5 正交试验

2.5.1 正交试验设计

选择乙醇用量、提取时间和提取次数3个因素,进行L9(34)正交设计;并以丹参酮ⅡA、丹酚酸B的提取率为指标,优选丹参合提工艺条件。因素水平见表3。

2.5.2 正交试验与结果分析

平行称取丹参药材9份,每份30 g,按L9(34)正交表试验条件,用70%乙醇进行加热回流提取、滤过,滤液合并至1 000 mL容量瓶中,加70%乙醇定容至刻度,摇匀,测定。结果及分析见表4~表6。表3 丹参集成提取因素水平表(略)表4 L9(34)丹参醇提工艺正交试验结果(略)表5 丹参集成提取正交试验丹参酮ⅡA方差分析表(略)注:F0.05(2,2)=19.00,*P<0.05 表6 丹参集成提取正交试验丹酚酸B方差分析表(略)注:F 0.01(2,2)=99,F 0.05(2,2)=19,*P<0.05,**P<0.01

方差和直观分析结果表明:因素C对丹参酮ⅡA及丹酚酸B的提取有显着影响,取3水平;其次为A因素,取3水平;B因素影响最小,可取1水平;最佳提取条件应为A3B1C3,但A和C因素的2水平与3水平相差不大,结合生产,拟取2水平,故拟确定提取条件为A2B1C2,即加8倍量70%乙醇,提取2次,每次1 h。

2.6 验证试验

按照正交试验优选醇提工艺条件进行验证试验,结果见表7;结合工业生产,选择优选工艺为丹参提取工艺,与正交试验各工艺结果比较含量较高,表明丹参脂溶性成分及水溶性成分基本提取完全,该醇提工艺条件可行。表7 丹参醇提工艺验证结果(略)

3 讨论

以醇提法从丹参中提取的水溶性成分主要是丹酚酸B,以水提法则包含丹酚酸B、丹参素及原儿茶醛等水溶性成分。药理研究 表明,两种提取方法所得部位的药理作用差异无统计学意义,且以醇提法所得的结果较好,并且随丹酚酸B含量提高而活性提高。鉴于此,我们选择丹酚酸B为水溶性成分的考察指标。

丹参水溶性成分中,主成分丹酚酸B对热不稳定,这在提取溶剂的选择中可看出。因此,我们先采用高浓度醇提再用水提,丹酚酸B提取率较低,可能为丹酚酸B长时间受热分解所致。为全面反映丹参有效成分,我们采用先醇提再水提的传统工艺与集成提取工艺相比较,得出集成提取的优选工艺。

本研究结果表明,集成提取能同时兼顾丹参脂溶性和水溶性成分,使丹参的提取工艺更为合理。

【参考文献】

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:化学工业出版社,2005.52.