ZT、KT和2,4—D对香蕉胚性愈伤组织诱导的影响

摘要 以香蕉未成熟雄花序为外植体，以MS为基本培养基，对外植体进行表面消毒、不同切割长度处理、不同植物生长调节剂（ZT、KT、2，4-D）在不同浓度情况下进行胚性愈伤组织诱导的试验。结果表明：外植体表面消毒以选用10% H2O2溶液处理效果最好，成功率为83.3%；切割长度以1.0 cm较为合适；胚性愈伤组织诱导最适培养基为MS+0.5 mg/L ZT+0.5 mg/L KT+4.0 mg/L 2，4-D，胚性愈伤组织诱导率为12.3%。

关键词 香蕉；胚性愈伤组织；诱导

中图分类号 S668.1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）08-0057-02

香蕉是芭蕉科（Muaceae）芭蕉属（Musa）多年生常绿大型草本单子叶植物，是热带、亚热带重要的经济作物。绝大多数香蕉品种都是三倍体，且多为Musa spp.，AAA群[1]。它们具有高度不育性，不能通过传统的杂交育种方式获得优质高抗性的香蕉新品种，利用基因工程、体细胞突变和体细胞杂交等方法，有望克服传统育种的限制，而生物技术的应用都需要高效稳定的植株再生体系。其中，香蕉的胚性细胞悬浮系的建立就成为香蕉实现转移基因、细胞融合、植株再生的关键技术[2-3]。因为胚性愈伤组织作为转化受体并诱导胚状体而再生的转基因香蕉可降低嵌合体发生，但是香蕉的胚性愈伤组织诱导率过低成为影响香蕉的胚性细胞悬浮系建立的关键因素。已有研究表明[4-5]，不同的激素种类及配比、外植体类型、培养条件对香蕉胚性愈伤组织的诱导有较大影响。研究ZT、KT和2，4-D在以香蕉未成熟雄花序为外植体诱导胚性愈伤组织过程中的最适配比，以达到有效缩短香蕉胚性细胞悬浮系建立时间和提高其转化效率的目的，为进一步开展香蕉的遗传转化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试香蕉品种为桂蕉B6（Musa spp.，AAA），由广西植物组培苗有限公司提供，取自国家香蕉产业技术体系常规育种岗位示范基地的无病、无虫、长势良好的香蕉植株。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体表面消毒。以未成熟雄花序为外植体材料，剥除花序的苞叶，直至未成熟雄花序长3 cm左右，进行以下3种处理。处理1：在70%酒精中浸泡90 s后取出，用无菌水冲洗4～5次，切取花序尖端1.5 cm材料接入培养基；处理2：在70%酒精中浸泡30 s，再用1 g/L升汞（HgCl2）浸泡60 s后取出，用无菌水冲洗4～5次，切取花序尖端1.5 cm材料接入培养基；处理3：在70%酒精中浸泡30 s，再用10% H2O2溶液处理60 s后取出，用无菌水冲洗4～5次，切取花序尖端1.5 cm材料接入培养基。每个处理100个样品，7 d后统计消毒情况，3次重复。

成功率（%）=1-污染率-死亡率

1.2.2 不同长度外植体对愈伤组织诱导的影响。以未成熟雄花序切段为外植体材料，按切割长度设3个处理，即切割成0.5 cm（A）、1.0 cm（B）、1.5 cm（C）。平放于愈伤组织诱导培养基MS+1.0 mg/L IAA+4.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L NAA+40 g/L蔗糖[6]，每个处理100个样品，30 d转接1次，150 d后统计愈伤组织的诱导情况，3次重复。

1.2.3 不同培养基对愈伤组织诱导率的影响。以MS为基本培养基，设计以ZT添加浓度0、0.5、1.0 mg/L；KT添加浓度0、0.5、1.0 mg/L；2，4-D添加浓度0、2.0、4.0、6.0 mg/L；以上3个植物生长调节剂组合的36个配方，另加NAA 0.01 mg/L、谷氨酰胺100 mg/L、生物素1.0 mg/L、甘露醇20 g/L、蔗糖40 g/L、琼脂6.5 g/L，灭菌前pH值调至5.8，按每瓶30 mL进行分装，在121 ℃灭菌20 min后，进行香蕉愈伤组织诱导试验。愈伤组织诱导在黑暗条件下进行，培养室温度为28 ℃。每个处理100个样品，30 d转接1次，150 d后统计愈伤组织的诱导率，3次重复。

诱导率（%）=愈伤组织诱导数/接种外植体数×100

2 结果与分析

2.1 不同处理方法对外植体消毒效果的比较

同种外植体应用不同的处理方法，其结果相差较大：处理1的污染率最高，但外植体的死亡率比处理2低，处理1的成功率略高于处理2；处理2的污染率较低，但是由于使用升汞进行消毒，所以出现了较高的死亡率，致使最后的成功率最低；处理3选择10% H2O2溶液对外植体材料进行处理，效果最佳，污染率最低，成功率最高。

2.2 不同长度外植体对香蕉胚性愈伤组织诱导的影响

幼嫩的未成熟雄花序接种到培养基14 d后开始膨大，50 d后在外植体的表面产生黄色的愈伤组织并出现大量褐化死亡情况。在接种150 d后进行观察统计，不同处理均获得了较高的愈伤组织诱导率，处理B的愈伤组织诱导率和胚性愈伤组织诱导率均略高于其他2个处理，分别为35.3%、5.3%。结果说明切割长度以1.0 cm较为合适。

2.3 不同培养基对香蕉胚性愈伤组织诱导的影响

香蕉细胞内含有大量的酚类物质导致愈伤组织褐化死亡，在培养基中添加适量的甘露醇（20 g/L）可以降低胚性愈伤组织的褐化程度[7]，保持愈伤组织能正常诱导及增殖生长。在添加甘露醇的培养基中，出现的愈伤组织褐化死亡现象明显减少，120 d后极少数愈伤组织表面出现黄白色、松脆、透明的胚性愈伤组织，随着培养时间的延长，胚性愈伤组织逐渐增多，对其进行组织学观察，在接种150 d后统计结果。在诱导香蕉胚性愈伤组织过程中，当2，4-D浓度低于4.0 mg/L时，香蕉胚性愈伤组织诱导率随着2，4-D浓度增大而升高；当2，4-D浓度高于4.0 mg/L时，香蕉胚性愈伤组织诱导率随着2，4-D浓度增大而下降，结果说明，2，4-D在诱导香蕉胚性愈伤组织形成中也起着非常关键的作用，最适宜浓度为4.0 mg/L。从表4可以看出，随着培养基中ZT的加入，香蕉愈伤组织诱导率和胚性愈伤组织诱导率得到显著提高，说明ZT对诱导香蕉胚性愈伤组织形成起到较好的促进作用，最适宜浓度为0.5 mg/L。而在培养基中加入KT后，香蕉愈伤组织诱导率和胚性愈伤组织诱导率无明显变化，但愈伤组织出现的时间提前7～10 d，说明KT对诱导香蕉愈伤组织形成起到一定的促进作用。筛选出诱导胚性愈伤组织最适培养基为MS+0.5 mg/L ZT+0.5 mg/L KT+4.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L生物素+100 mg/L谷氨酰胺+20 g/L甘露醇+40 g/L蔗糖，愈伤组织诱导率为53.7%，胚性愈伤组织诱导率为12.3%。

3 结论与讨论

研究结果表明，外植体不同消毒方法、不同切割长度[8]均对愈伤组织诱导产生一定影响。在香蕉胚性愈伤组织诱导过程中，当2，4-D浓度在4.0 mg/L时，能从香蕉未成熟雄花序诱导出愈伤组织，这一结果与朱 军等[9]诱导巴西蕉愈伤组织时所用的2，4-D浓度相吻合；在添加的3个植物生长调节剂中，2，4-D在香蕉愈伤组织的诱导中起着关键的作用[3]。ZT具有高效、稳定等特点，在该研究中对愈伤组织和胚性愈伤组织诱导过程中起到较好的促进作用，同2，4-D配合使用后效果更佳，与赵 辉等[10]对巴西香蕉吸芽进行胚性组织诱导结果相符。在诱导香蕉胚性愈伤组织过程中，KT起到使愈伤组织出现的时间提前的作用。通过探讨不同外植体表面消毒方法、不同外植体接种长度、不同植物生长调节剂在不同浓度情况下对香蕉胚性愈伤组织诱导的影响，进一步改进香蕉胚性细胞悬浮系建立时间及转化率。如能在此基础上建立起高效、重复性好的香蕉胚性细胞悬浮培养技术体系，将对香蕉转基因技术的研究起到推动作用。

4 参考文献

[1] 胡永华，黄惠琴.香蕉转基因研究进展[J].中国生物工程杂志，2004，24（5）：34-37.

[2] 徐春香，PANIS B，STROSSE H，等.香蕉胚性愈伤组织的诱导及胚性细胞悬浮系的建立[J].华南农业大学学报：自然科学版，2004，25（1）：70-73.

[3] 魏岳荣，黄学林，李佳，等.贡蕉胚性细胞悬浮系的建立和植株再生[J].生物工程学报，2005，21（1）：58-65.

[4] 冯新富，谢丽君，陈厚彬，等.香蕉愈伤组织及体细胞胚诱导过程中的组织学观察[J].果树学报，2007，24（6）：788-791.

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[6] 张秀枝，叶惠玲，叶锦华.香蕉、大蕉、粉蕉胚性愈伤组织的诱导[J].农业与技术，2007，27（5）：66-69.

[7] 温睿婷，王汉宁，杨如涛，等.降低玉米成熟胚愈伤组织褐化的初步研究[J].分子植物育种，2010，8（3）：483-487.

[8] 严华兵，方锋，卜朝阳，等.魔芋组培苗叶柄切段愈伤组织诱导及植株再生[J].南方农业学报，2011，42（2）：121-123.

[9] 朱军，胡永华，黄惠琴，等.巴西蕉愈伤组织的诱导[J].热带农业科学，2006，26（3）：15-17.

[10] 赵辉，彭明，曾会才，等.巴西香蕉吸芽高效胚性再生体系研究[J].果树学报，2011，27（5）：730-734.