参芎注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

摘要： 目的：研究参芎注射液对老龄大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。 方法：108只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、尼莫通组、参芎注射液高、中、低剂量组（36.4，18.2，9.1 mL・kg-1・d-1）。采用线栓法建立大鼠脑缺血再灌注模型，观察参芎注射液对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能评分、脑梗死体积的影响，检测脑组织中一氧化氮合酶（NOS）、一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、乳酸脱氢酶（LDH）的含量，ELISA法检测对脑组织中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）水平的影响。结果：参芎注射液可显著降低脑缺血再灌注大鼠的神经功能评分，减轻脑组织损伤程度，减少脑梗死范围，提高SOD活力，降低MDA，NO，NOS，LDH水平，抑制IL-1β和TNF-α的表达。结论：参芎注射液对大鼠缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，其机制可能与改善神经功能、减少自由基损伤和抑制炎症因子表达有关。

关键词： 参芎注射液；脑缺血再灌注损伤；自由基；炎症因子；神经功能

[稿件编号] 2013-06-21

[基金项目] 国家自然科学基金项目（81173647，81202636，81274176）；浙江省自然科学基金项目（LR12H27001）；浙江省卫生高层次创新人才培养工程项目；浙江省中医药（中西医结合）重点学科项目（2012-XK-A06）

[通信作者] *杨洁红，Tel：13758244937，E-mail：

[作者简介] 汪兴宇，Tel：（0571）86613716，E-mail：

近年来，脑缺血再灌注损伤的研究已经引起了国内外学者的广泛关注，大量研究[1-3]表明脑缺血再灌注损伤主要与自由基连锁反应、炎症反应、钙离子超载、兴奋性氨基酸毒性和细胞凋亡等有关。许多研究[4-5]表明丹参和川芎对脑缺血损伤的氧化、炎症及神经功能损伤等有较明显的改善作用。参芎葡萄糖注射液为丹参提取物和川芎嗪复合的针剂，对脑缺血再灌注大鼠的血液流变学、神经细胞凋亡等损伤有较好的改善作用[6-7]，但有关自由基损伤和炎症损伤方面的研究较少。本实验采用线栓法建立局灶性脑缺血再灌注（MCAO）模型，研究参芎注射液对脑缺血再灌注损伤中的神经功能损伤、自由基损伤和炎症损伤的改善作用，探讨其对缺血脑组织的保护作用及机制。

1 材料

1.1 药品和试剂 参芎注射液（吉林四长制药有限公司，批号20120804）；尼莫通注射液（Bayer Schering Pharma AG，批号BXG2GG1）；考马斯亮蓝试剂盒（批号 20121206）、MDA检测试剂盒（批号20121205）、一氧化氮（NO）检测试剂盒（批号21021123）、SOD试剂盒（批号20121130）、一氧化氮合酶（NOS）检测试剂盒（批号20121211），以上均购自南京建成生物工程研究所；IL-1β ELISA检测试剂盒（上海源叶生物科技有限公司，批号20121101A）；TNF-α ELISA检测试剂盒（上海源叶生物科技有限公司，批号20121101A）；TTC（北京鼎国昌盛技术有限责任公司，批号16S10320）。

1.2 仪器 Varioskan Flash型酶标仪（Thermo公司）；Sigma 2-16PK离心机（Sigma公司）；TU-1900型双光束紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；赛多利斯（Sartorius）BS110S电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）。

1.3 动物 清洁级SD大鼠，雄性，体重260～300 g，上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号SCXK（沪）2008-0016。

2 方法

2.1 分组与给药 108只SD大鼠随机分为6组，每组18只，分别为假手术组（腹腔注射生理盐水）、模型组（腹腔注射生理盐水）、参芎注射液低、中、高3个剂量组（9.1，18.2，36.4 mL・kg-1・d-1）和尼莫通组（腹腔注射尼莫通注射液5.00 mL・kg-1・d-1，相当于尼莫地平1 mg・kg-1・d-1）。各组每天腹腔注射给药2次，于手术前连续给药3 d。

2.2 脑缺血再灌注模型制备 参照Zea Longa等[8]的改良的线栓法制备大脑中动脉栓塞（MCAO）模型：10%水合氯醛（3 mL・kg-1）腹腔给药麻醉大鼠后，分离右颈总动脉并剪一小口，将长50 mm、直径0.2 mm、顶端烫制成光滑球状的尼龙线作为栓子插入，以颈总动脉分叉处计算进线深度为（18.5±0.5） mm，至大脑中动脉起始部以完全阻断供血。缺血1.5 h后，拔线栓，再灌注24 h。假手术组只进行麻醉和血管分离术，不结扎血管及导入尼龙线。以上过程均在室温恒定（24～25 ℃）情况下进行。

2.3 神经功能评分 参考Bederson等[9]的方法对各组动物的行为缺陷进行神经功能评分，评分标准如下：0分，提尾悬空时，动物的两前肢均伸向地板方向且无其他行为缺陷；1分，提尾悬空时，动物的手术对侧前肢表现为腕肘屈曲、肩内旋、肘外展、紧贴胸壁；2分，将动物置于光滑平面上，推手术侧肩向对侧移动时阻力降低；3分，动物自由行走时，向手术对侧环转或转圈。

2.4 脑梗死范围测定 评分后大鼠断头取脑去嗅球、小脑和低位脑干，用双面刀片将大脑沿冠状面切成厚度基本相同的5片，放入2%TTC染色液中，37 ℃水浴中温育30 min，正常组织呈红色，梗死组织呈白色。再将脑片置4%多聚甲醛中固定24 h内拍照留用，用Image J2x图像分析软件计算脑梗死体积。

2.5 脑组织中SOD，NOS，NO，MDA，LDH和炎症因子IL-1β，TNF-α检测 大鼠于缺血再灌注24 h后，乙醚麻醉后断头取脑，全脑称重后，用冰冷的生理盐水冲洗，放入匀浆管中，加入适量4 ℃生理盐水进行匀浆，上下转动研磨制成10%的组织匀浆。以3 000 r・min-1离心15 min，取上清液，分为8份。考马斯亮蓝法测定总蛋白，按照试剂盒说明分别对脑组织匀浆中的SOD，NOS，NO，MDA，LDH进行测定，ELISA法检测炎症因子IL-1β和TNF-α的表达。

2.6 统计学分析 全部实验数据以±s表示，均采用SPSS 19.0统计软件进行方差分析，P

3 结果

3.1 参芎注射液对脑缺血再灌注大鼠神经功能和脑梗死体积的影响 大鼠脑缺血再灌注24 h后，大鼠均出现了不同程度的行为障碍，模型组行为学评分为（2.67±0.71），参芎注射液低、中剂量组神经行为学评分与模型组比较，神经功能有明显改善（P

脑缺血1.5 h再灌注24 h后，假手术组脑组织TTC染色呈均匀的玫瑰红色。模型组脑组织可见局灶性白色拒染区域即梗死灶（P

A.假手术组；B.模型组；C.参芎高剂量组；D.参芎中剂量组；E.参芎低剂量组；F.尼莫通组。

图1 大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织TTC染色结果

Fig.1 TTC staining of brain tissue of cerebral ischemia-reperfusion injury in rats

3.2 参芎注射液对脑缺血再灌注大鼠脑组织SOD，MDA，LDH的影响 大鼠脑缺血1.5 h再灌注24 h后，引起脑组织LDH和MDA水平的显著升高（P

3.3 参芎注射液对脑缺血再灌注大鼠脑组织NOS，NO的影响 大鼠脑缺血1.5 h再灌注24 h后引起脑组织tNOS，iNOS和NO水平的显著升高，差异有统计学意义（P

3.4 参芎注射液对脑缺血再灌注大鼠脑组织IL-1β，TNF-α的影响 大鼠脑缺血1.5 h再灌注24 h后引起脑组织IL-1β和TNF-α水平的升高（P

4 讨论

脑缺血再灌注时，机体内自由基清除系统功能下降，氧自由基的产生大量增加，广泛攻击易损区不饱和脂肪酸双链的生物膜结构，引发脂质过氧化“瀑布状”连锁反应，产生大量MDA，导致膜结构和功能的破坏。自由基还可进一步向周围穿透、延伸，使边缘带脑细胞进一步损伤。而SOD是人体最重要的自由基清除剂，当自由基显著增多时SOD消耗增加，SOD活性就会明显下降。脑缺血再灌注过程中产生的NOS可诱导谷氨酸兴奋毒性，加重缺血/再灌注损伤。NOS产生过量的一氧化氮，能与超氧阴离子形成ONOO-和OH-，导致DNA氧化，抑制DNA修复酶的作用，损伤线粒体膜，使线粒体形成漏道，开放线粒体转换孔，使细胞能量衰竭。本实验结果显示，参芎注射液各剂量组均能显著降低脑组织中MDA，NO的含量，抑制NOS，LDH活力并增加SOD的活力，能有效抑制氧化作用并清除一氧化氮自由基，对脑缺血再灌注大鼠脑部的自由基损伤有较好的保护作用。

脑缺血再灌注后，炎症因子白介素[10]（主要是IL-1β）、肿瘤坏死因子-α[11]（TNF-α）等被激活，导致内皮细胞的紧密连接破损，并最终导致血脑屏障通透性增加。TNF-α对血管有直接毒性作用，导致血管痉挛，增加血管通透性。本实验结果显示，参芎注射液各剂量组均能显著抑制缺血后脑组织中IL-1β和TNF-α的表达，有效抑制炎症级联反应。

本实验中，参芎注射液能显著减少脑梗死体积，改善神经功能，对于脑缺血再灌注损伤中的自由基损伤和炎症损伤有较明显的改善作用。文献报道中，有关参芎注射液对脑缺血再灌注损伤中的自由基损伤研究较少，本研究从氧化自由基和一氧化氮损伤入手，对脑缺血再灌注损伤中的自由基损伤机制进行了考察，为研究参芎注射液保护脑缺血再灌注损伤的机制提供参考，并为中药配伍在脑血管方面的用途提供实验依据。

[参考文献]

[1] 程钢，程迪，沈夕坤，等.氧化苦参碱对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用及其抑制凋亡的作用机制[J]. 中国药理学通报，2013， 29（3）： 387.

[2] 倪彩霞，曾南，许福会，等.芳香开窍药对脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障影响的实验研究[J].中国中药杂志， 2011， 36（18）： 2562.

[3] 尚远宏，徐晓玉.中药及其提取物对脑缺血保护作用的实验研究进展[J].中国中药杂志，2013，38（8）： 1109.