渐进式流式细胞术实验教学的实践与思考

[摘要] 本研究在培养“应用型人才”和“研究型人才”的方法上做了探索，提出了渐进式的实验教学方案。针对流式细胞术的渐进式实验教学模式能有效的提高学生的学习热情和实验技能，为建设“研究型大学”贡献力量。

[关键词] 渐进式；流式细胞术；实验教学

[中图分类号] G642 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2013）22-136-03

Practices and opinions of progressive experimental teaching model for flow cytometry

SU Li ZHAO Jingxia YANG Genjin LOU Ziyang

College of Pharmacy， the Second Military Medical University， Shanghai 200433，China

[Abstract] In this work， we expored the methodology of training "applied talents" and "research talents" and proposed a progressive experimental teaching program. The progressive experimental teaching model for flow cytometry can effectively improve the students' enthusiasm and expetimental skills， thereby contribute to the building-up of a research university.

[Key words] Progressive； Flow cytometry； Experiment teaching

随着科学与技术的发展，流式细胞术已成为药物研发和临床诊断的基础技术之一[1-2]。近年来，我们针对药学和医学等专业的学员开设了流式细胞术的实验课程，使学员理解和掌握相关理论知识，锻炼学员实验技能，取得了良好的效果。今年，在大学创建研究型大学的理念指导下，我们进行了实验教学模式的改革。根据人才培养类型的不同，我们针对性的设计了“应用型实验教学”和“科研型实验教学”的渐进式的的教学模式，不仅培养了学员扎实的动手能力和实验技能，而且让相关专业的学员对流式细胞术有了更深层次的理解，为他们将来的科研工作提供新的思路。

1 针对低年级本科生的应用型实验教学模式

“应用型实验教学”要求学员根据实验设计，验证已知结论，使学员学会仪器使用，理解和掌握相关知识。“应用型实验教学”旨在普及仪器知识，提高学员的学习兴趣，为深入运用仪器打好基础。这种教学模式主要针对医药专业的本科一、二年级的学员和非医药专业的选修学员。课程的设计包括仪器原理及构造介绍、实验设计和上机检测三个环节。学员通过8个学时的学习，一方面能够掌握基本的仪器操作技能，另一方面加深对相关理论知识的理解，熟悉流式的常用数据图谱。

针对低年级学生的知识构成我们选择原理和操作相对简单的细胞周期分析和细胞凋亡作为演示实验。我们先对学员进行了2个学时理论讲解，然后按照实验设计安排学员分组展开实验，图1[3]、2[9]是实验数据图谱。根据学员的反馈信息，这种理论加实践相结合的实验教学方式较受大家欢迎，既能提升学员的学习热情，提高学员的求知欲望，又能切实的体验到科研工作的严谨性。

图1 人肝癌细胞细胞凋亡实验（Annexin-V/PI法）

图2 人肝癌细胞周期分析实验

2 针对高年级本科生和研究生的科研型实验教学模式

“科研型实验教学”要求学员深入到实验的整个过程中去，在“应用型实验教学”的基础上细分流式检测的每个步骤，设计并优化实验方案，从而获取理想实验结果的综合型实验教学模式。研究型人才是创建研究型大学的基础，先进的创新思维和高水平的研究能力是研究型人才的基本素质。“科研型实验教学”让学员熟悉并理解科研工作中整个实验方案的设计流程和实验结果的优化手段，培养学员解决实际问题的能力。这种教学模式主要针对医药专业的本科高年级的学员和相关专业的研究生。流式检测流程细分为如下环节：细胞培养与收集、荧光抗体的选择与孵育、对照样本的设计、样本检测。我们针对每个环节对学员进行了详细的解读，包括基本的实验方法、注意事项和一些经验技巧等。

2.1 细胞培养与收集

流式细胞实验，细胞状态至关重要。荧光抗体是根据抗原抗体特异性结合的原理粘附到细胞膜表面或者细胞内的，细胞损伤严重会导致某些受体的缺失，严重影响结果的阳性率，而细胞碎片的增加也会导致荧光抗体的非特异性结合增加，从而导致结果的假阳性率增加。我们获取的单细胞尽量选取对数生长期的，此时细胞状态良好，细胞铺板浓度要合适，不能过稀或者过密；消化细胞的手段应当温和，消化细胞所用的酶尽可能不含EDTA，消化时间不能过长；离心时转速不能过高，通常选择在1000～1500r/min；转移细胞悬液时尽量不产生气泡。

2.2 荧光抗体的选择和孵育

流式细胞术是根据荧光的强弱来实现定性和定量，选择合适的荧光试剂是取得好的实验数据的前提。商品化的荧光试剂品种众多，我们优先选择发光效率高的试剂，这样细胞的阴性和阳性表达区分明显，有利于我们进一步数据统计；尽量选择直接标记的荧光抗体，如需要间接标记的抗体，要考察其一抗二抗的结合效率；多色荧光同时检测的时候要考虑到荧光宽光谱的特性，尽量选择交叉小的荧光配对，避免交叉干扰。

孵育荧光抗体时要选取合适的孵育条件和抗体浓度。通常抗原抗体最适的反应温度是25℃，这个温度下蛋白处于类似机体内的生理状态，有利于蛋白质间相互作用，个别的抗体需要特殊的孵育环境，比如冰浴、37℃水浴等；荧光抗体的剂量过多或者过少都会影响定量的准确性，荧光试剂过多会导致染色过度，增加假阳性率，过少则会染色不完全，导致假阴性。试剂盒建议的荧光抗体剂量针对的细胞浓度是106个/mL，这个剂量通常都是过饱和的，我们正式实验前应当做预实验来确定实际所加的试剂量。

2.3 对照样本的设计

流式细胞术中对照的设计通常包括空白对照、同型对照、单阳性对照、生物样本对照等。空白对照是指单细胞悬液，除了没有加荧光试剂其余都是平行操作，空白对照的作用是用来确定细胞的基础信号，查看有没有背景荧光。某些细胞含有自发荧光蛋白，对于这种样本我们选择的荧光抗体应当避开这个荧光，避免假阳性。同型对照的目的是在空白对照的基础上进一步确定阴性和阳性细胞群体的分界线。单阳性对照是多色荧光同时检测时，只加了其中某一种荧光抗体的对照，目的是用来调节荧光补偿的。多色荧光同时检测，荧光补偿是个难点，补偿不好会导致荧光泄露到其他检测通道中，导致该通道的假阳性率增加。试剂公司有相应的补偿微球提供4种及以上的多色检测，我们建议使用补偿微球，使用相应的配套软件来设置仪器条件，通常都能得到较好的补偿效果。需要注意的是，微球虽然可以模拟细胞和荧光抗体结合，但是由于颗粒大小、表面褶皱程度和胞内密度都和真实的细胞有较大差别，所以使用微球设置好检测条件后还需用生物样本加以验证。

特别需要提到的是FMO对照（荧光扣除对照），FMO对照是多色荧光染色时确定门边界的最佳选择，且可用于补偿调节。所谓FMO对照，就是从染色的方案里面，去掉所要分析的那个指标，例如我们要分析FITC通道的荧光表达率，那么就要从组合中去掉FITC标记的抗体。图3就显示了未染色标本或同型对照均无法正确设置设门边界，而FMO对照可以。图4更加显示了当补偿未调节到位时，FMO依然可以做到正确设门[4-7]。

图3 同型对照和FMO对照设门对比

图4 补偿不足情况下同型对照和FMO对照设门对比

同型对照无法提供设门参照，这是因为每一种抗体均存在其特异性或非特异性结合能力，同型对照虽然与抗原特异性的抗体来源亚型是一样的，但是其结合活性还是会存在一些差异。因此同型对照不适合用来区分阳性和阴性的界限[8]。

2.4 样本检测

流式细胞术的检测样本是新鲜的单细胞悬液。通常我们是用PBS缓冲液来重悬细胞。PBS具有跟细胞近似的离子浓度和PH值，因此细胞在PBS缓冲液中能够短时间的保持正常的生理状态，这是流式细胞术的优势之一，然而PBS中没有营养物质，细胞放置久了也会引起损伤；并且染色试剂中的荧光素在光照下会发生淬灭。综上所述，我们通常要求样本要避光保存，在染色完1h内要上机检测才能得到可靠的实验结果。如果样本的获取和检测不能同步，我们则需要对样本进行固定，通常所用的固定液有10%的中性甲醛固定液、75%的乙醇固定液和丙酮固定液等[10]。

通过对流式细胞术的几个重要步骤的详细讲解，学员对这项技术有了更加深刻的理解，设计实验方案时综合考虑多方面因素，具体操作时注意每个细节，均能在实际实验中取得预期的结果。

渐进式的实验教学课程自去年开展以来取得了良好的教学效果。在本科层次培养出应用型人才，学员不仅能学到原理知识、仪器技能，还能锻炼动手能力和综合素质。在研究生层次，学员通过深入的学习强化了对实验技术的理解，在具体的实验中体会科研工作的严谨，并结合自己所学专业的理论和其他技术，加强自身的科研能力。研究型大学需要高水平的人才梯队，随着高校教育体制改革的不断深入，建设高精尖人才培养的实验教学平台是大势所趋，我们分析测

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试中心在这方面进行了大胆的探索和不懈的努力，为第二军医大学创建“研究型大学”贡献一份力量。

[参考文献]

[1] Richard R.Jahan-Tigh，Caitriona Ryan，Gelinde Obermoser，et al. Flow Cytometry[J].Journal of Investigative Dermatology，2012，132：282.

[2] Bendall SC，Nolan GP，Roederer M， et al.A deep profiler’s guide to cytometry[J].Trends Immunol，2012，33：323-32.

[3] Bendall SC，Simonds EF，Qiu P， et al.Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum[J].Science，2011，332：687-696.

[4] Herzenberg LA，Tung J，Moore WA， et al.Interpreting flow cytometry data： a guide for the perplexed[J].Nal Immunol，2006，7：681-685.

[5] Roederer M.Spectral compensation for flow cytometry：visualization artifacts，limitations，and caveats[J].Cytometry，2001，45：194-205.

[6] Kyle RA，Rajkumar SV.Multiple myeloma[J].N Engl J Med，2004，351（18）：1860-1873.

[7] Yuan CM，Stetler-Stevenson M.Role of flow cytometry of peripheral blood and bone marrow aspirates in early myeloma[J].Semin Hematol，2011，48（1）：32-38.

[8] 彭萍，陈霖，杨丽华，等.流式细胞术在免疫学中的应用研究[J].现代诊断与治疗，2012，23（12）：2159-2160.

[9] 贾永蕊.流式细胞术在DNA检测中的应用[J].中国医学装备，2010，7（4）：4-6.

[10] 熊见，解小红，王长本，等.流式细胞术检测网织红细胞的多参数分析及方法评价[J].检验医学与临床，2010，7（13）：1295-1296，1298.

（收稿日期：2013-10-21）