电色谱的研究与应用介绍

【关键词】 电色谱；色谱柱；检测器；应用

【中图分类号】R318 【文献标识码】A 【文章编号】1003-8183（2013）11-0280-02

电色谱，是在毛细管电泳的基础上发展起来的一种高效分离技术，属于高效毛细管电泳的一种模式。最早的电色谱是Mould和Syng将电场应用到薄层液相色谱中，用来分离寡聚糖的。但“电色谱”一词首先是在1974年，由Pretorius等[1] 首先提出的，他将电场引入到HPLC中，显示了以电渗流为流动相的推动力进行分离的巨大优势。后来，Jogenson等[2]在170μm内径的毛细管中填充10μm粒径的Partisil ODS-2，成功地分离了9-甲基蒽等多环芳烃，获得了31000 m- 1理论塔板数的柱效并发表了论文。这是毛细管电泳发展史上的里程碑。之后涌现了许多关于毛细管电泳的应用和理论研究，从理论和试验中证实了电色谱的分离效率明显高于HPLC。之后，电色谱开始进入商品化，阎超等研制了世界上第一台专用梯度加压电色谱仪。2003年已有集成式加压毛细管电色谱商品仪出售。各种联用技术也相继出现，如毛细管电色谱与核磁共振、质谱的联用。毛细管电色谱正处于不断蓬勃发展中。

1 电色谱的特点

电色谱是采用细颗粒固定相填充的毛细管柱或将固定相涂渍到毛细管内壁，在电场（有时候辅助电压）的驱动下，利用样品溶液中组分的分配系数，电泳淌度的差异而实现分离的液相分离技术[3]。在驱动力上，其采用电场作为驱动力，流动相为塞状流型，所以具有毛细管电泳的高分离效能，同时引入了HPLC中的高压泵辅助驱动，可以在柱系统电渗流速度较低的情况下，有效地缩短样品的分析时间，此外还可以通过改变泵压和分离电压来调节样品中各组分的保留，提高分离度[3]，这也可以弥补毛细管电泳分离中性混合物的不足[4]，必要时还可以采用梯度洗脱来分离极性差别比较大的混合物。另外使用加压电色谱还可以减少毛细管中的气泡产生[5]，提高重现性。在色谱柱上，毛细管中可以填充和键合各种固定相，除了淌度差异外，还引入了分配、吸附等分离机制，使其具有HPLC的高选择性。在流动相上，电色谱主要使用缓冲盐，溶剂消耗少，成本低，还可以加入有机改性剂或者添加剂改善分离效果，甚至完全用有机溶剂作流动相，成为非水毛细管电色谱（NACEC）。因此，电色谱是综合两种分离模式的优点而产生的，具有高分离效能、高选择性、高速度、高灵敏度、样品用量少、溶剂消耗少、应用范围广的特点。

2 色谱柱

同HPLC一样，色谱柱是电色谱的核心。根据色谱柱固定相的填充方式不同，可以分为填充毛细管电色谱（PCCEC），开管毛细管电色谱（OTCEC），整体式毛细管电色谱（MCEC）[6-7]。现分别对三种类型的毛细管电色谱做简单的介绍。

2.1 填充毛细管电色谱 填充柱式就是在各种不同孔径的毛细管内填充高效液相色谱常用填料，如ODS、硅胶、硅胶键合其他官能团（如C18、PH、CN、NH2等）、手性固定相等，以此作为分离基质。目前最常见的填料为多孔ODS，其粒径为3μm或5μm[8]。填充方式主要有匀浆填充法、拉伸填充法和电动填充法。电动填充法较好，可以得到非常均匀的填充柱床，且填充时间短，柱效较高[9]。但填充柱需要制备柱塞，这不仅需要比较高的工艺要求而且柱塞容易产生气泡，气泡的产生会增大组分迁移的阻力，甚至可能中断电泳过程。

2.2 开管毛细管电色谱 开管柱是在毛细管内涂敷或者键合含有带电或者分配选择性的固定相的一种分离柱[9]。开管柱的制备方法主要有三种：表面涂渍固定相、表面粗糙化后键合固定相和溶胶-凝胶技术[9]。表面涂渍固定相方法简单，但柱的寿命短。表面粗糙化键合固定相是为了增大毛细管的内表面积，首先对毛细管内壁进行蚀刻，然后将固定相键合到内壁上。溶胶-凝胶技术就是将含烷基链的烷氧基硅烷作为溶胶溶液的前体，利用溶胶-凝胶化学在毛细管内壁形成有孔的有机硅胶薄膜，从而在增大毛细管内表面的同时引入具有保留功能的官能团[9]。如采用四乙氧基硅烷（TEOS）、正辛基三乙氧基硅烷（C8-TEOS）、乙醇、盐酸和水按一定的比例搅拌一段时间，TEOS和C8-TEOS水解产生原硅酸，原硅酸缩聚产生硅凝胶。水解和缩聚同时进行，但水解速度大于缩聚速度。在水解结束后，将凝胶注入活化的毛细管中，缩聚反应继续进行，毛细管璧上的硅羟基也参与反应，从而将部分硅凝胶固定在管壁上；将剩余的凝胶用氮气冲出，缩聚反应继续进行，固定在管璧上的凝胶通过干燥和老化形成一薄层带有固定相的多孔硅胶[10-11]。开管柱缺点是柱效比填充柱低，柱容量比填充柱小。

2.3 整体式毛细管电色谱 整体式色谱柱又称为连续床式色谱柱，是通过原位聚合或熔凝在毛细管中形成连续、整体、多孔的固定相床层[12]。按照聚合物制备的原料，整体柱分为有机聚合物整体柱，无机聚合物整体柱和有机-无机杂化整体柱。有机整体柱是利用两种有机物在毛细管内发生聚合反应，形成连续的固定相。如Ye[13]等采用甲基丙烯酸缩水甘油酯和亚乙基二甲基丙烯酸酯聚合制备了中性的聚合物整体柱，然后再聚合物表面修饰了一层胰岛素用于在线消化蛋白质。有机整体柱的不足之处在于有机物容易发生溶胀，稳定性较差[9]。

无机整体柱也叫硅胶整体柱，是以烷氧基为主要原料，以溶胶-凝胶技术制备的整体柱。硅胶整体柱具有良好的耐溶剂和高低温性能，比表面积大，易于控制孔结构，机械强度高等优点[14]。除了一般的硅胶整体柱，利用硅胶基质固定相表面带有大量的硅羟基，可进一步进行衍生化修饰，如引入强极性基团氰基，乙二胺基团等，形成表面修饰改性的硅胶毛细管整体柱。

有机-无机整体柱集合了有机整体柱和无机整体柱的优点，其无机部分可提供机械强度稳定的聚合骨架，而结合于无机相上且均匀分布的有机基团可以改善固定相的性能。其采用溶胶-凝胶法，以硅氧试剂和带有其他功能基团的硅氧烷试剂作为反应前驱体，可以在温和的条件下制备。

3 检测器

毛细管电色谱是一种微分离，分离通道内径一般为50-100μm，进样量一般是纳升级的，这就对检测器的灵敏度提出了很高的要求。除了使用常规的紫外-可见检测外，还需要灵敏度更高的荧光/激光诱导荧光检测器，电化学检测器，化学发光检测器，为了配合分析的需要，还可以与质谱，核磁共振技术联用。

其中，荧光/激光诱导荧光检测器（FL/LIF）是毛细管电色谱中用的较多的另一种商品化的仪器。其最大的优点就是灵敏度高。特别是LIF，应用强度高，相干性好的激光作为激发光，其检测限可达10-14～10-16mol/L，可进行超痕量分析。但是其激发波长和发射波长单一，激光器寿命短，价格昂贵，而且自然界中很多非荧光活性物质需要进行衍生化处理后才能使用，这些都限制了LIF的应用。

4 电色谱的应用

毛细管电色谱是一种高效，快速的分离手段，广泛应用于各个领域，如生物大分子蛋白质、核酸的分离分析，环境监测，残留农药的检测，化工，食品中营养成分和添加剂的分离检测，药物的分析，复杂中药成分的分析等。现就其在药学方面分离物质的应用做简要的介绍。

4.1 手性药物的分离 手性药物的分离主要有三种方法：一是使用手性固定相，二是在流动相中使用手性添加剂，三是将药物进行手性衍生化生成非对映异构体复合物。常用的是使用手性毛细管柱，常用的是将环糊精、蛋白质、胆酸盐、冠醚，大环内酯，多糖等具有手性识别作用的物质键和到毛细管柱内壁。分子印迹毛细管电色谱整体柱在手性药物分析及结构很相近物质之间的分离中卓有成效。分子印迹技术（MIT）是模拟自然界所存在的分子识别作用，如酶与底物、抗体与抗原等，以目标分子为模板合成分子印迹聚合物的方法，这种印迹聚合物对目标分子具有专一识别性[26]。Lin等以丹酰化-L-亮氨酸作为手性印迹分子，通过本体聚合法制备了MIP柱，并在这种柱子上分离了丹酰化-D，L-亮氨酸对映体。

4.2 酸、碱性药物的分析 在使用常见的ODS固定相分析酸性药物时，由于在一般的高的PH下，酸性药物一般带负电，分离时间延长，甚至不出峰。分离碱性药物时，由于固定相表面硅羟基对碱性化合物具有吸附作用，常常会出现峰拖尾、保留时间重现性不佳及不出峰等现象。可以参考HPLC的分离模式，从以下三个方面进行解决。采用离子抑制的分离模式；采用离子对作用调节酸性药物的分离；采用反相或者亲水作用的色谱与阴、阳离子交换混合模式固定相，可以在流动相组成较大的范围内得到较强且稳定的电渗流。另外，Lin[15]等报道了一种两性对羟基甘氨酸硅胶整体柱，其电渗流的大小和方向可通过调节流动相的PH值来控制，应用于酸性和碱性物质的分离。

4.3 药物膜通透性筛选中的应用 脂质体与生物膜组成及性质上相似，将脂质体固定在毛细管内壁形成脂质体电色谱，可以研究药物与脂质体的相互作用，能最大程度的反映药物分子与生物膜相互作用的真实情况，作为一种体外筛选工具，加快了药物的膜通透性高通量筛选。其制作方法包括物理涂布和化学键和，除了用于研究药物与生物膜的作用外，还可以用来研究多肽、蛋白质与生物膜的作用[16]。

4.4 微全分析系统中的应用 微全分析系统（μ-TAS）是通过化学分析设备的微型化与集成化，最大限度地把分析实验室的功能转移到便携的分析设备中，甚至集成到方寸大小的芯片上，最终目标是实现分析实验室的“个人化”、“家用化”，从而使分析科学及分析仪器从化学实验室解放出来，进入千家万户[17]。由于芯片上通道的直径只有几十微米，甚至更低，填充固定相后有效尺寸显著降低，驱动该系统所需要的压力将远高于目前HPLC所采用的压力[18]，成为HPLC在μ-TAS应用中的很大的障碍。CEC中产生电渗流为柱塞流，其大小几乎不受填充介质颗粒直径的限制[19-20]，说明通过降低孔径来提高分离效率不会降低色谱的驱动力-电渗流，从而使CEC应用于芯片结构时更有优势。

5 总结

电色谱作为上个世纪八十年代兴起的一种分离技术，经过了约四十年的研究，在理论和应用上都得到了发展。目前在药学方向应用较多，发展最快，但是电色谱凭借其高效、快速、高选择性等优势，必将活跃于其他领域，如环境监测，水质分析、公共卫生监测等。其一，电色谱应用最多的流动相是缓冲液系统，这与水质分析的样品完全匹配，可以不经过处理直接进样；其二，电色谱可以与多种检测器联用，可以满足环境样品高灵敏度的要求；其三，电色谱具有的小的柱内径和流速，这跟质谱有很好的适应性，可给出物质的分子量和结构信息，可以实现其对样品的定性监测和定量控制。随着电色谱的发展与成熟，我们期待其在环境监测、水质分析、公共卫生监测等领域有新的突破。

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