川芎嗪对缺氧时视网膜血管内皮细胞HIF—1α、VEGF表达及细胞增殖的影响

[摘要] 目的 研究川芎嗪对缺氧时体外培养的牛眼视网膜血管内皮细胞（BREC）VEGF表达及细胞增殖活性的影响，探讨川芎嗪治疗视网膜新生血管性疾病的药理机制及可行性。 方法 CoCl2模拟缺氧处理培养的BREC细胞，用浓度分别为20、40、120 μg/mL的川芎嗪分别加入细胞培养液中24 h，采用ELISA法检测细胞培养上清液VEGF含量，免疫组织化学法和生物荧光法分别检测细胞PCNA的表达、细胞内ATP含量以分析细胞增殖能力，采用免疫组织化学法检测HIF-1α的表达。 结果 川芎嗪可减少缺氧引起的视网膜血管内皮细胞中PCNA的表达，降低细胞内ATP含量，降低培养上清液中的VEGF浓度，且呈剂量依赖性。 结论 川芎嗪可抑制缺氧引起的视网膜血管内皮细胞的增殖。其机制可能是通过抑制HIF-1α途径来实现的。

[关键词] 川芎嗪；视网膜新生血管；血管内皮生长因子；缺氧诱导因子

[中图分类号] R-33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2012）11（b）-0005-02

笔者在缺氧时的牛眼视网膜血管内皮细胞（BREC）培养上清液中加入不同浓度的川芎嗪，研究其对HIF-1α表达的影响，及对体外培养的血管内皮细胞增殖的作用，探讨川芎嗪的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

盐酸川芎嗪注射液，由无锡市第七制药有限公司生产，规格为40 mg/2 mL，批号010913。药物用培养基稀释至所需浓度。F12 培养基（Gibco，美国）；兔抗HIF-1α多克隆抗体（武汉博士德）；胎牛血清（Gibco，美国）；EBM-2 Basal Meidum（北京毕特博）。免疫组化采用北京中山公司免疫组化试剂盒（二步法）。其他试剂皆为分析纯。

1.2 BREC细胞的培养

取死后3 h内健康牛眼（取自潍坊肉联厂），70%酒精浸泡，角膜缘后4 mm剪开，剥出视网膜神经层，剪碎、匀浆，孔径80 μm金属筛网过滤，洗脱液离心（1 000 r/min，7 min），0.02%胶原酶Ⅰ消化（37℃，1～2 h），离心洗涤并收集细胞，接种于鼠尾胶原培养皿内，20%胎牛血清的M199和EBM-2混合培养液，放入37℃ 5%CO2培养箱培养。培养液次日更换继续培养。以后每3天换液1次。长至近融合状态时，用0.1%胰蛋白酶消化、传代细胞。血管内皮细胞鉴定采用第Ⅷ因子相关抗原检测法，纯度为90%以上[1]。

1.3 细胞处理及分组

将对数生长期的BREC细胞分别以浓度1.5×105/mL细胞悬液接种于24 孔培养板，置于37℃ 5%CO2培养箱内培养24 h，细胞分为以下3组：F12培养基常规培养组（正常对照），模拟缺氧组（加入终浓度125 μmmol/L的CoCl2）和药物治疗组（加入含不同浓度川芎嗪20、40、120 μg/mL），各组分别培养24 h，每项指标每组各测6个培养孔，分别取平均值。

1.4 培养上清液VEGF含量ELISA法测定

按照说明书步骤严格进行操作，在酶标仪波长492 nm比色定量。所有标本均作双管检查，对VEGF含量在标准曲线最高值以外的标本稀释10～100倍后重新测定。

1.5 PCNA免疫组化

-10℃甲醇固定培养细胞5 min，用3%H2O2孵育5 min后冲洗，加入1∶100稀释的一抗于4℃过夜，洗后滴加山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体，37℃孵育20 min，PBS洗后以DAB显色。阴性对照以PBS 液代替一抗。结果以胞核内有棕黄色颗粒为阳性判定标准，高倍镜下（×400）随机选择每张切片5个视野，采用计算机图像分析系统进行灰度分析。

1.6 细胞内ATP含量测定

培养孔中加入煮沸的PBS 3 mL，振荡后立即吸入试管中，沸水浴10 min后冰水冷却，低温离心13 000 r/min 15 min，将上清液试管置于冰水中待测。反应杯中加入样品0.2 mL，放入荧光光度计反应暗室，微量进样器向反应杯中注入荧光素-荧光素酶液0.8 mL，测定相对发光强度。按绘制好的ATP标准曲线计算出ATP含量。

1.7 HIF-1α免疫荧光染色

-10℃甲醇固定培养细胞5 min，冲洗后，0.3%H2O2吐温30 min，PBS洗3 次，1∶100稀释的RABBIT Anti-HIF-1α细胞于4℃过夜，洗后滴加FITC标记山羊抗兔IgG抗体，37℃孵育60 min，PBS冲洗细胞后于荧光显微镜下观察。阴性对照以PBS液代替一抗。结果判定以细胞核或胞浆呈绿色荧光为阳性标准，每张切片随机选择5个视野在高倍镜下（×400）采用计算机图像分析系统进行荧光分析。

1.8 数据处理

应用SPSS 10.0统计分析软件包进行。数据均以均数±标准差（x±s）表示，组间比较用t检验。P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血管内皮细胞培养上清液VEGF的检测

表1显示，缺氧时BREC细胞培养上清液中VEGF浓度增加，而不同浓度的川芎嗪可减少缺氧引起的VEGF增加，且呈剂量依赖性。当川芎嗪浓度为20 μg/mL时，其培养上清液VEGF水平已显著下降（P < 0.05）。见表1。

2.2 血管内皮细胞PCNA、HIF-1α的表达及ATP含量

表1显示，缺氧时BREC细胞中PCNA、HIF-1α表达及ATP含量均增加，而不同浓度的川芎嗪可减少缺氧引起的PCNA、HIF-1α表达增加及ATP浓度升高，且呈剂量依赖性。当川芎嗪浓度为20 μg/mL时，其PCNA、HIF-1α表达及ATP含量水平已显著下降（P < 0.05）。

3 讨论

川芎嗪化学名为四甲基吡嗪，近年以川芎总生物碱中分离出1号结晶为甲荃吡嗪，3号结晶为佩洛里因[2]。1号结晶药理研究证明是一种新型钙离子拮抗剂，有活血化瘀，抗血小板凝集，兴奋延髓呼吸中枢及血管运动中枢，扩张血管及支气管平滑肌，改善微循环等作用[3]。因其治疗心脑血管疾病疗效好、副作用少而广泛用于临床[4-6]。

本研究中，笔者发现缺氧时BREC细胞中PCNA表达增加，细胞内ATP含量增加，而不同浓度的川芎嗪可减少缺氧引起的PCNA表达，降低细胞内ATP含量，且呈剂量依赖性。当川芎嗪浓度为20 μg/mL时，其PCNA表达、细胞内ATP含量已显著下降（P < 0.05）。表明川芎嗪可抑制缺氧引起的血管内皮细胞的增生。这与以往报道相符[5-8]。本实验中同时发现缺氧时BREC细胞培养上清液VEGF增加，而不同浓度的川芎嗪可减少缺氧引起的VEGF增加，且呈剂量依赖性。当川芎嗪浓度为20 μg/mL时，其培养上清液中VEGF水平已显著下降（P < 0.05）。表明川芎嗪可抑制缺氧引起的血管内皮细胞VEGF分泌的增加。

本研究中，笔者还发现缺氧时诱导BREC细胞中HIF-1α表达增加，而不同浓度的川芎嗪可减少缺氧引起的HIF-1α表达，且呈剂量依赖性。当川芎嗪浓度为20 μg/mL时，其细胞中HIF-1α水平已显著下降（P < 0.05）。这可能提示川芎嗪还可以通过抑制HIF-1α途径来抑制VEGF的表达，从而抑制血管内皮细胞的增殖活性，这在以往文献[7-12]中未见报道。

综上所述，川芎嗪可减少缺氧时的视网膜血管内皮细胞VEGF的分泌，从而抑制缺氧引起的视网膜血管内皮细胞的增殖。其机制可能是通过抑制HIF-1α途径来实现的。

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（收稿日期：2012-09-24 本文编辑：林利利）