对粉防己碱抑制人卵巢癌HO-8910细胞生长的研究

【摘要】 目的; 探讨粉防己碱对人卵巢癌细胞株HO-8910增殖与凋亡的作用。方法 ;MTT 法测定细胞增殖情况;吖啶橙荧光染色(AO)观察细胞凋亡的形态学变化;流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡。结果 粉防己碱对HO-8910细胞有抑制增殖作用,呈时间、剂量依赖性;光镜可观察到细胞凋亡的形态学变化;流式细胞术检测结果分析,实验组G1/G0期上升,S期和G2/M期下降,细胞凋亡率上升。结论; 粉防己碱在体外能抑制卵巢癌HO-8910细胞增殖,诱导HO-8910细胞发生凋亡。

【关键词】 粉防己碱 ;卵巢癌 ;增殖; 凋亡

粉防己碱(Tetrandrine)别名称汉防己甲素,是从中草药粉防己的块根中提取的双苄基异喹啉类生物碱,对高血压、心律失常、肺纤维化等疾病具有较好的疗效。近年来的研究表明,粉防己碱可抑制多种肿瘤细胞生长,作为一种潜在的抗肿瘤药物,其相关研究颇受关注。卵巢癌是女性生殖器官三大恶性肿瘤之一,其死亡率高居妇科肿瘤之首,术后化疗仍是卵巢癌最重要的辅助治疗措施,但由于化疗的毒副作用及肿瘤抗药性的增加其疗效显着降低,我们从抗肿瘤的植物药中,筛选出粉防己碱,观察其对卵巢癌HO-8910细胞的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 人卵巢癌细胞株HO-8910(中科院上海细胞所提供);粉防己碱(江西银涛药业有限公司),25℃溶于DMSO中;胰蛋白酶、RPMI-1640、吖啶橙、胎牛血清(华美生物公司);MTT及二甲亚砜DMSO(sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人卵巢癌HO-8910细胞株,培养基为RPMI-1640内含10%灭活胎牛血清、37℃、5%二氧化碳的饱和湿度培养传代。

1.2.2 实验分组 共分5组:实验组:加入粉防己碱,终浓度分别为1.0mg/L,5.0 mg/L,10.0 mg/L及20.0 mg/L组;对照组:加入等量的RPMI-1640培养液(每组设6个复孔)。

1.3 实验指标的检测

1.3.1 MTT试验

取对数生长期的HO-8910细胞,制成浓度为1×105个/mL的单细胞悬液,接种于96孔培养板中,每孔200μL,过夜贴壁后;实验组加入1.0mg/L, 5.0 mg/L,10.0 mg/L及20.0 mg/L的粉防己碱,对照组加等量的RPMI-1640。每组设6个复孔,继续培养24、48h后加入MTT(5mg/mL) 20μL/孔,4h后吸净上清液,加入DMSO 20μL/孔,震荡10min,用酶标记光仪在波长为560nm时测定每孔的吸光度(A)值,计算不同浓度抗体对细胞增殖的抑制率[抑制率=(对照组A均值-实验组的A均值) /对照组A均值 [1]]。

1.3.2 AO染色

取对数生长期的HO-8910细胞,制成浓度为5×105个/mL的单细胞悬液,按上述粉防己碱浓度培养48h后,离心弃上清,用PBS洗3次,95%乙醇固定15~30min;1%醋酸酸化30s;加入0.01%AO染色1~5min,封片,镜下观察并摄影。

1.3.3 流式细胞仪检测细胞周期

取对数生长期的HO-8910细胞,制成浓度为1×106个/mL的单细胞悬液,按上述浓度培养24h后,收集细胞,PBS洗涤,制成单细胞悬液,用70%的冰乙醇4℃固定12h,用含核糖核酸酶及碘化丙锭的染液染30min,上流式细胞仪进行检测。

1.3.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率

取对数生长期的HO-8910细胞,制成浓度为1×106个/mL的单细胞悬液,接种于6孔培养板中,按上述浓度培养24h后,收集细胞,用AnnexinV-FITC/PI双标记染色后做流式细胞仪双色分析。

1.4 统计学处理

采用SPSS13.0统计软件进行统计分析,所有数据均用±s表示,统计方法采用方差分析,组间比较采用q检验。

2 结 果

2.1 MTT试验结果

实验结果显示:粉防己碱对HO-8910细胞的生长具有明显的抑制作用, 实验范围内最大抑制率达61.35%,且抑制作用随药物浓度增加、作用时间延长而增强,呈现剂量、时间依赖性作用, 经统计学检验差异具有显着性意义(P< 0.01,见表1)。

表1 实验组和对照组卵巢癌细胞内的吸光度值和增殖抑制率(±s)组别粉防己碱

(mg/L)24h吸光度值(±s)抑制率(%)48h吸光度值(±s)抑制率(%)对照组00.605±0.00600.608±0.0050实验组10.562±0.004*7.110.535±0.003*12.0150.508±0.009*16.030.420±0.005*30.92100.450±0.008*25.620.325±0.003*46.55200.333±0.008*44.960.235±0.003*61.35

注:同一作用时间采用方差分析及q检验*P<0.01;同一浓度组采用t检验P<0.05

2.2 AO染色

凋亡细胞体积明显缩小,核碎裂,核内可见浓缩边集的染色质,呈新月形或肾形致密浓染的黄绿色染色,荧光亢进 (图1)。

2.3 粉防己碱对卵巢癌细胞周期分布和凋亡率的影响

不同浓度粉防己碱作用卵巢癌细胞24h后,与对照组相比,细胞周期分布、凋亡率均发生改变,即G1/G0期细胞比例数上升,S期和G2/M期下降,细胞凋亡率上升,均有显着差异(P<0.05),且与粉防己碱浓度之间具有剂量依赖性(P<0.05,见表2)。

表2 粉防己碱对卵巢癌细胞周期分布和凋亡率的影响(±s)注:采用方差分析*P<0.01

3 讨 论

粉防己碱是一种具有广泛药理学作用的双苄基异喹啉类生物碱,是粉防己的主要有效成分。早期研究表明粉防己碱具有消炎、镇痛、降压、抗纤维化等广泛的药理作用。近年来的研究证实粉防己碱是天然的非选择性的钙通道阻滞剂,又是钙调蛋白的拮抗剂,具有直接抗肿瘤的作用。Kuo等[2]发现,粉防己碱不仅抑制人肝癌Hep G2细胞株的生长,还可诱发凋亡。何琪扬[3]等采用台盼蓝计数法发现粉防己碱对敏感急性白血病细胞株HL260和抗三尖杉酯碱的HL-60细胞均有生长抑制作用。王瑞珍[4]等用粉防己碱处理人食管癌细胞,观察到肿瘤细胞分裂指数低于对照组约50%。Dong Y[5]等观察到粉防己碱可抑制HL260细胞生长,认为粉防己碱可通过诱导肿瘤细胞凋亡而抑制肿瘤细胞生长。

本研究也发现,粉防己碱明显抑制人卵巢癌HO-8910细胞的生长。本实验采用MTT法检测不同时间和剂量的粉防己碱对体外培养的HO-8910细胞增殖的影响。结果证实粉防己碱对HO-8910细胞的增殖具有显着抑制作用,且呈时间、剂量依赖性。流式细胞仪检测细胞周期显示随着粉防己碱的浓度的增大,G1/G0期比例升高,S期、G2/M期降低,提示粉防己碱具有G1/G0期阻滞作用,使进入S期细胞明显减少,阻碍细胞进入DNA合成期。粉防己碱阻止卵巢癌细胞周期的进展,说明粉防己碱抑制卵巢癌HO-8910细胞增殖可能与其阻滞细胞周期的有序进行有关,从而诱导卵巢癌细胞的调亡。流式细胞仪检测卵巢癌细胞凋亡率亦表明:粉防己碱随浓度的增大其对HO-8910细胞的凋亡率增大,呈剂量依赖关系,且与对照组比较均具有显着差异(P<0.01)。AO染色也观察到了凋亡细胞的形态学变化。

本研究为临床应用粉防己碱治疗恶性肿瘤提供了一定的实验依据。粉防己碱毒副作用小, 对肝肾功能无损害,无 骨髓抑制,是一种有效且较安全的抗肿瘤药物,而且我国有丰富的中草药资源,利用现代科学技术可使其发挥更大的作用。(此文图1见附页2)