离心洗涤对形态的影响

【摘要】 目的 探讨常规形态学染色中离心洗涤步骤对分析结果的影响。方法 47例人标本进行常规检测密度及活力后，分别在离心前后涂片，应用快速苏木素-伊红染色法进行染色，检测头部、体部、尾部畸形率。对比畸形指数(sdi)和畸形指数(tzi)是否受到离心洗涤的影响。结果 离心洗涤后的头部畸形率和正常率较离心前直接涂片无显著差异，体部畸形率、尾部畸形率、sdi、tzi各指数在离心前后的差异均有统计学意义。不经过离心洗涤精浆而直接采用who推荐的制备涂片方法的标本染色后碎屑较多，但是不影响分析。结论 形态学分析中离心对畸形指数(sdi)和畸形指数(tzi)有影响。但是不影响形态正常的比率。不经离心洗涤直接涂片适用于非严重少精及黏稠度低的标本。

【关键词】 ;离心;洗涤;形态;染色

impact on sperm washing by centrifugate on sperm morphometry

liang lin，zhao xiao-xi，wang li-yan，et al.inner mongolia department of medical college first affiliated hospital gynaecology and obstetrics reproductive center，hohhot 010050，china

[abstract] objective to evaluate the influence of sperm washing on accuracy of sperm morphometry.methods semen analyses were carried out according to the world health organization manual for 47 subfertile men，film preparation before and after centrifugate washing，then use he dyeing，and assess the deformity ratio of sperm head,body,tail and sdi,tzi.results the diversity ratio of deformed head and normal sperm have no significant difference before and after the washing procedure，but the ratio of body,tail abnormity，sdi，tzi have disparity，and the difference have statistical significance.the direct film preparation recommend by who without washing have more foreign matter after staining,but didn’t influence analyses.conclusion these results indicate that sperm washing by centrifugate in morphology analyses has impact on sdi and tzi.but have no influence on the ratio of eumorphism sperm.the direct film preparation is applicable for the non-severity oligospermatism and the specimen of hypo-viscidity.

[key words] sperm;centrifugate;washing;morphology;staining

在不孕夫妇中，男性因素导致的不孕约为25%～40%。常规分析在评价质量方面应用广泛，形态作为参数的组成部分，是反映质量的重要指标[1]。功能与的正常形态密切相关。而畸形的增加，也是男性生育力受损的标志之一。正常形态率越低凋亡率越高。将常规与形态学分析相结合，有助于提高男性不育症的诊断率[2]。

形态在评估受精能力及预测辅助生殖技术治疗结局方面，也发挥了很大作用。形态越差，其自然妊娠的能力就越低。由于各实验人员所采用的标准及判断不一致，在对形态分析方面结果出入颇大[3]。但是对形态做出准确的评估，对需要采用辅助生殖技术来满足其生育要求的畸形症患者非常重要，有助于找到适合的处理方法及行辅助生殖技术治疗时选择最佳的受精方式[4]。本研究通过统计化验中各项畸形指标，为其形态学检测的标准化提供思路。

1 资料与方法

1.1 标本 47例来自本中心就诊的男性不育患者，年龄在24～39岁，禁欲2～7天，法取精。常规检查参考世界卫生组织《分析手册》(第4版)。入选标本的密度在(59.42±39.67)×106/ml。

1.2 实验方法

1.2.1 标本制备 标本在常规分析后直接涂片，若密度检查小于20×106/ml，取10～20 μl直接涂片;若密度高于20×106/ml，取5 μl在载玻片上拉薄，空气中自然干燥。同份标本加入5倍体积的生理盐水，在800 g下离心10 min去除精浆，轻弹试管使离心后的团重新悬浮于盐水中，取20～40 μl涂片。光镜下观察密度，以无重叠为准，过稀或过密需重新涂片。

1.2.2 标本染色 方法采用快速苏木素-伊红染色法(he)染色[5]，干燥后的涂片在90%酒精中固定30 min，流水冲洗后将涂片在苏木素中染5 min，再次冲洗后在伊红溶液中染色5 min，流水冲洗玻片后室温干燥。在油镜视野下观察并进行计数。

1.2.3 分类标准 采用kruger严格评分标准，每份标本连续计数200个，分别记录头部、体部、尾部畸形的百分率和正常形态比率。其中头部畸形中将大头畸形和小头畸形分别标记。最后统计畸形指数和畸形指数。

1.3 统计学方法 采用spss 11.0统计软件进行分析，统计资料以均数±标准差(x±s)表示，各项畸形以百分率表示，均数比较用t检验。p<0.01为差异有统计学意义。

2 结果

47例非严重少精患者在离心前后分别计数头、体、尾部畸形比例，结果如表1所示。正常形态比率在离心洗涤前后无显著差异(p>0.01)。头部畸形比率(包括大头畸形和小头畸形)也不受离心洗涤的影响(p>0.01)。考虑到检测样本数量，但初步可得结论，离心后体部和尾部畸形率减少，sdi与tzi也减小，差异具有统计学意义(p<0.01)。

3 讨论

形态测定是常规分析中最重要的临床指标之一。但形态又比较难测定准确和稳定。目前使用人工方法评价形态存在主观性，不同实验室甚至同一实验室内部检测结果的偏差广泛存在[6]。因此，减少操作中的不确定因素对形态分析的影响很重要。现大多男科实验室采用的是对标本均用生理盐水洗涤后再涂片分析。而离心力的作用对形态学的影响还不确定。有研究认为离心力的作用易使得细胞体形态发生改变[7]。本实验将在离心洗涤前后的形态做对比分析，发现离心后体部畸形及尾部畸形显著减少。因此可考虑在密度检验非严重少精的标本形态分析时按照who推荐的涂片方法直接涂片染色。表1 离心前后计数头体尾畸形比例注：*p<0.01

有学者认为对于人工授精来讲，未处理中正常形态百分率在很低的情况下均不影响iui结局[8]。那么对于因男性因素而寻求辅助生殖技术帮助的患者来讲，形态学的准确判定便可以有助于选择最佳的治疗方式。离心步骤会去除死和杂质[9]，一定程度上使正常形态增加，在形态检测时就要考虑到这一点[10]。garcía-herreros等[11]认为洗涤可以影响头的大小，在快染的标本中尤其显著[11]。本实验中尚未观察到头部畸形受到影响。

在ivf的治疗实践中发现，受精率低下(<30%的卵子受精)和受精失败(所有卵子都不受精)的患者很常见(20%～30%)。形态异常可能就是ivf受精率低下的一个重要因素[12]。有研究显示，受精失败组中畸形比例显著高于受精组[13]，7%左右的形态严重畸形患者有-透明带结合反应缺陷[14]。文献报道正常形态率对顶体反应率[15]、ivf受精率、卵裂率有显著影响，而对ivf或icsi其他治疗结局尚无明显相关[16]。正常形态在4%～14%时卵子仍有63.9%的受精率，而边缘性参数异常易导致受精失败[17]。因此对于男性畸形患者应严格评分标准，考虑畸形比率再行部分卵子icsi以避免受精失败，同时因男方因素而采取icsi治疗的患者就应充分考虑到边缘性参数。

chen等[18]研究认为按照who的分析标准评估的参数对于ivf来讲作用并不是很大。但是tzi和sdi较其他参数更有价值[18，19]。aziz等[20]研究认为，sdi对衡量不育男性尤其是精浆内ros过高的是个重要的检测手段。统计tzi和sdi指数是否在离心前后具有显著性差异，可以相对的判断染色前操作对结果的影响。男科实验室的责任就是让检验参数更准确。本实验提示在染色过程中使用洗涤步骤对参数有一定影响，反映在tzi和sdi在离心洗涤前后均有统计学差异上(p<0.01)。由于本实验观察的标本数量有限，缺乏大样本系统性对比，其对临床应用辅助生殖技术的指征影响作用需要在今后的工作中进一步深入研究。

【参考文献】

1 蒋敏，陈新敏，岳焕勋，等.形态学分析在男性不育症诊断中的应用.中国优生与遗传杂志，2007，15(6)：106-107.

2 李然伟，刘睿智，许宗革，等.凋亡与密度、活力、形态关系探讨.中国实验诊断学，2007，11(6)：776-779.

3 岳焕勋，蒋敏，李福平，等.精索静脉曲张不育患者的质量和形态学观察.中华男科学，2005，11(12)：933-935.

4 李志凌，谢文燕.辅助生殖技术中的优选处理.生殖医学杂志，2007，16(3)：209-212.

5 刘德一，hw gordon baker.功能检测与男性不育诊治的新进展.中华男科学杂志，2007，13(2)：99-109.

6 刘睿智，宋贺.计算机自动形态分析仪(asma)对形态的分析.中国实验诊断学，2004，8(3)：311-313.

7 张青松，文波，陈敏.体外处理对形态的影响及妊娠结局的临床观察.中国优生与遗传杂志，2007，15(7)：83-84.

8 karabinus ds，gelety tj.the impact of sperm morphology evaluated by strict criteria on intrauterine insemination success.fertil steril，1997，67(3)：536-541.

9 vijayakumar r，ndubisi b，de leon f，et al.sperm wash in three culture media：maximization of motile sperm recovery during swim-up incubation.andrologia，1987，19(5)：579-584.

10 scott rt jr，oehninger sc，menkveld r，et al.critical assessment of sperm morphology before and after double wash swim-up preparation for in vitro fertilization.arch androl，1989，23(2)：125-129.

11 garcía-herreros m，aparicio im，barón fj，et al.standardization of sample preparation，staining and sampling methods for automated sperm head morphometry analysis of boar spermatozoa.int j androl，2006，29(5)：553-563.

12 崔险峰.应用严格形态学测定法评估形态对体外受精率的影响.中华男科学杂志，2006，12(9)：842-843.

13 师娟子，薛侠，张洲，等.畸形症与常规体外受精失败.中华男科学杂志，2009，15(2)：106-109.

14 liu dy，baker hw.high frequency of defective sperm-zona pellucida interaction in oligozoospermic infertile men.hum reprod，2004，19(2)：228-233.