槲皮素在HepG2细胞中抑制胆固醇蓄积所致的炎性反应

【摘 要】目的：研究槲皮素（Quercetin）对HepG2细胞胆固醇蓄积所致炎性反应的抑制作用及机制。方法：双荧光素酶报告基因活性试剂盒检测槲皮素对人NPC1L1启动子活性的影响，荧光定量PCR检测NPC1L1 结果：槲皮素可剂量依赖性抑制NPC1L1启动子的活性和NPC1L1 mRNA的表达；结论：槲皮素可通过抑制NPC1L1启动子的活性下调其表达，从而实现对胆固醇蓄积所致炎性反应的抑制作用。

【关键词】槲皮素 NPC1L1表达 胆固醇摄取 炎症反应

人NPC1L1蛋白在肝脏表达丰富，位于肝细胞基底膜，负责重吸收胆汁中的游离胆固醇入肝[1]。研究还发现，NPC1L1是新型降脂药物依泽替米贝（ezetimibe）的分子靶点， ezetimibe通过阻断NPC1L1进而减少小肠及肝脏对胆固醇的吸收[2]。体外和体内研究均报道，ezetimibe可显著改善胆固醇负荷导致的内质网应激、抑制炎症反应以及肝脏损伤。因此，NPC1L1成为NASH治疗的一个新的候选靶点。

槲皮素（quercetin）是一种常见的植物雌激素，也是异黄酮类化合物的主要成份之一。现在的研究发现槲皮素具有广泛的药理作用，具有抗氧化、降血脂和抗肿瘤等效应[3]。研究显示槲皮素可调节肝脏脂质的代谢，但对NASH的防治作用还不清楚。基于上述报道，我们开展本实验探讨槲皮素对NPC1L1启动子活性的影响，从而对其介导的胆固醇负荷和炎性反应的影响及可能的机制。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌细胞株HepG2来自武汉大学细胞典藏中心（武汉，中国），人NPC1L1启动子双荧光素酶报告基因质粒（pGL4.17-hNPC1L1）及内参质粒由娄晓亚博士惠赠（中南大学林药理研究所，长沙，中国），DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶购于Gibco 公司（美国），DMSO、槲皮素和水溶性胆固醇购于Sigma 公司（美国），ezetimibe购自TRC公司（加拿大），细胞增殖活力检测试剂盒和双荧光素酶报告基因活力检测试剂盒购自Promega公司（美国），Lipofectamine2000、Trizol、TNF-α和IL-6 ELISA试剂盒购于Invitrogen公司（美国），逆转录及荧光定量PCR试剂盒购于Takara公司（日本），细胞内总胆固醇检测试剂盒购自普利莱公司（中国，北京）。

1.2 细胞培养

HepG2细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37度含5% CO2的培养箱内。取对数生长期细胞用于实验。HepG2细胞用0.25%的胰酶消化后铺板（96孔），达到60-70%融合时用不同浓度槲皮素（2.5、5、10、20、40μM）进行处理。

1.3 双荧光素报告基因活性检测

HepG2细胞消化后铺板（24孔），达到60-70%融合时，用lipofectamine2000按照说明书转染pGL4.17-hNPC1L1和内参质粒，转染24小时后用不同浓度槲皮素（5、10、20、40μM）处理24小时，按照说明，使用Promega双荧光素酶报告基因活力检测试剂盒检测其活性并分析。

1.4 数据处理和统计分析

采用SPSS18.0软件包进行数据分析。所有数据均采用均数±标准差（mean+SD）表示。组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），P

2 实验结果

2.1 槲皮素对NPC1L1启动子活性的影响

我们利用双荧光素酶报告基因实验检测槲皮素对NPC1L1启动子活性的影响，HepG2细胞转染pGL.17-hNPC1L1质粒及内参质粒24小时后，不同浓度槲皮素处理（5、10、20、40μM）处理24小时，再用试剂盒检测其活性，结果发现，如图1所示，与DMSO组相比，槲皮素可浓度依赖性抑制NPC1L1启动子的活性，10μM槲皮素即可显著下调NPC1L1启动子的活性。

2.2 槲皮素下调HepG2细胞中NPC1L1的mRNA表达水平

不同浓度（5、10、20μM）槲皮素处理HepG2细胞24小时后提取RNA进行定量，观察槲皮素对NPC1L1 表达水平影响。从图2知，与DMSO组相比，槲皮素处理可剂量依赖性显著下调NPC1L1 mRNA水平。

3 讨论

近年来，随着生活水平的改善，我国NASH的发病率逐年增高，但缺乏有效的A防和治疗方法。有研究发现，NASH的发病与肝脏胆固醇负荷密切相关[4]。研究标明，肝脏胆固醇的过度蓄积可诱发内质网应激，通过引发线粒体损伤以及肝kuffer细胞和星状细胞的活化，最终导致胰岛素抵抗和炎症反应，造成肝脏的损伤[5]。在本实验中，我们发现槲皮素可下调肝细胞NPC1L1启动子活性，进而下调HepG2细胞NPC1L1的表达；抑制NPC1L1介导的胆固醇蓄积及炎症反应。

人体胆固醇水平的动态平衡受到胆固醇的自身合成、小肠对胆固醇的吸收以及胆汁胆固醇的分泌三条途径的严格控制。人NPC1L1蛋白是小肠和肝脏（重）吸收胆固醇的关键蛋白，因此NPC1L1表达的高低对于维持全身及肝脏胆固醇动态平衡有着重要的意义[6]。多种脂质代谢相关的转录因子参与了NPC1L1的表达调控。研究发现，SREBP2和PPARα可与NPC1L1启动子区域特异性序列结合，说明两者可通过直接结合NPC1L1启动子上调其表达[7]。已有报道，槲皮素可通过抑制多种转录因子如SREBP-1c及PPARα的表达减少脂质的生成[8]。在本实验中，我们发现槲皮素可抑制NPC1L1启动子活性进而下调肝细胞中NPC1L1的表达，其机制可能是通过PPARα途径进行调控。

参考文献：

[1] Charlton MR， Burns JM， Pedersen RA， sing RA.et al. Frequency and outcomes of liver transplantation for nonalcoholic steatohepatitis in the United States [J]. Gastroenterology， 2011；141：1249-53.

[2]Caballero F， Fernández A， De Lacy AM， et al. Enhanced free cholesterol， SREBP-2 and StAR expression in human NASH [J]. J Hepatol， 2009；50：789-96.

[3]Van Rooyen DM， Larter CZ， Haigh WG， et al. Hepatic free cholesterol accumulates in obese， diabetic mice and causes nonalcoholic Steatohepatitis [J]. Gastroenterology， 2011；141：1393-403.

[4]Altmann SW， Davis HR J， Zhu LJ， et al. Niemann-Pick C1 Like 1 protein is critical for intestinal cholesterol absorption [J]. Science； 2004；303： 1201-1204.

[5]Temel RE， Tang W， Ma Y， et al. Hepatic Niemann-Pick C1-like 1 regulates biliary cholesterol concentration and is a target of ezetimibe [J]. J Clin Invest； 2007；117： 1968-78.

[6]Garcia-Calvo M，Lisnock J，Bull HG，et al. The target of ezetimibe is Niemann-Pick C1-like 1 （NPC1L1） [J]. Proc Natl Acad Sci； 2005； 102： 8132-8137.

[7]Tang W， Jia L， Ma Y， et al. Ezetimibe restores biliary cholesterol excretion in mice expressing Niemann-Pick C1-like 1 only in liver [J]. Biochim Biophys Acta； 2011；1811：549-55.

[8]Nomura M， Ishii H， Kawakami A， et al. Inhibition of hepatic Niemann-Pick C1- like 1 improves hepatic insulin resistance [J]. Am J Physiol Endocrinol Metab； 2009；297：1030-8.