酵母富硒工艺优化研讨分析

摘要：本文通过正交试验，对酵母富硒工艺进行了优化。结果表明：酿酒酵母具有较强的富硒能力。在适宜的条件下，以YEPD为培养基、加硒量16mg/L、8的接种量、28℃培养30h，有机硒含量可达12.39mg/L、转化率为82.62.

关键词：酿酒酵母；富硒；优化研究硒是人体生命中不可缺少的微量元素之一，在人体内总含量为14~20毫克，广泛分部于所有组织器官中，浓度高者有肝、胰、心、脾、牙及指甲，而脂肪组织中浓度最低，它对人体的正常代谢起着重要的调节作用，因而被喻为“生命火种”、“抗癌之星”。同时硒是一种稀散元素，不同地区食物中的硒含量不同，这与地理环境中的硒含量有关，在世界27个国家及美国几十个洲的流行病理学调查研究结果表明：土壤、食品、水中的含硒水平越低，癌症及心脑血管疾病的发病率及死亡率越高。硒是构成谷胱甘肽过氧化物酶的成份，参于辅酶A和辅酶Q的合成，是良好的营养调节剂、抗氧化剂、对抗金属的解毒剂，缺“硒”将会导致40多种疾病的发病率增高。然而自然界的“硒”在地壳中的含量极低，且与其它元素共生，人体难以吸收，全世界共有40多个国家缺硒，我国缺硒省份高达22个。目前国内外盛行用无机硒作为补硒制品，如亚硒酸钠片剂。但是无机硒与有机硒相比，有生物活性低而毒副作用大，且不易吸收等问题。针对我国缺硒现象是普遍存在的这一现状，如能通过每天摄入一定量的富硒食品即能达到理想的补硒效果，从而实现强身健体、延长寿命的作用己成为目前功能性食品研究的迫切课题之一。在研究众多的富硒制剂和食品添加剂中，酵母经富硒培养后得到的富硒酵母，因其自溶物中有机硒含量高，同时还含有丰富的氨基酸、核苷酸、多肽、蛋白质和一些微量元素与维生素，可作为良好的富硒食品的添加剂而倍受重视。而如何获得含硒量高的酵母是一个重要的前提，本文研究了酿酒酵母1605富硒工艺的优化。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种酿酒酵母1605。1.1.2培养基（1）YEPD培养基　葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母膏1％，自然PH值，固体加2琼脂、121℃灭菌15分钟。（2）麦芽汁培养基　自制麦芽汁10º（采用分段糖化法，将麦芽粉:水＝1:3混匀，先在54℃糖化1h，再升温到65℃糖化30~40分钟，再在72℃糖化40分钟，煮沸过渡，调糖度至10º），pH=6.0。（3）加入的硒均单独灭菌。1.1.3试剂0.2mol/LEDTA-2Na；5NaOH；0.53、3′-二氨基联苯胺；甲苯；1:1HCl；1μg/ml硒标准溶液等。1.1.4仪器722S分光光度计；LRH－150B生化培养箱；SW-CJ-1F超净工作台；DSX－280A不锈钢手提式消毒器；TGL-16G高速台式离心机；101-2型干燥箱等。1.2方法菌种活化驯化培养基配制发酵培养发酵液分离清洗新鲜硒酵母干燥(100℃，5h)富硒酵母取上清液硒含量测定计算酵母硒含量及有机硒转化率1.2.1菌种活化、驯化将少量固体原种接入YEPD液体培养基中，在28℃培养25小时，后再转接入加有适量硒的YEPD液体中进行驯化培养。1.2.2富硒工艺优化首先通过预备试验确定因素和水平，然后通过正交试验确定其最优化工艺条件。1.2.3酵母产量的测定将待分离发酵液用高速离心机4000rpm离心20分钟，分成两部分，上清液取出备后续测定使用，下层酵母沉淀用无菌水清洗两遍，得新鲜湿酵母。将湿酵母置100℃的烘箱内干燥至恒重。1.2.4酵母中硒含量的测定及富硒能力(有机硒转化率)计算-3，3′-二氨基联苯胺比色法1.2.4.1测定原理在PH2~3条件下，硒与3、3′－二氨基联苯胺（DAB）反应形成稳定的Se-DAB络合物，显色反应在30分钟内完成。在PH6左右时，通过甲苯萃取，在该体系中络合物最大吸收波长为420nm。可通过分光光度计测定其吸光度，先绘制出标准硒曲线，然后再测出样品吸光度，可从该标准曲线上查出对应的硒含量。1.2.4.2硒标准溶液准确称取0.1000g硒，置于50ml小烧杯中，力入1:1盐酸10ml,加热溶解，冷却并转移至100ml容罱瓶中，用10％硝酸溶液洗小烧杯合并沈液于容帚瓶中，并用10％硝酸稀释至刻度。此溶液每毫升含1毫克硒，用时可稀释成每毫升含1微克硒。1.2.4.3标准曲线绘制准确吸取1μg／ml硒标准液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml，分别移入分液漏斗中，加水至35ml。分别加入5％EDTA-2Na溶液1ml，摇匀，用1:1盐酸调节pH2-3左右，各加0.5％3，3′-氨基联苯胺溶液4ml，摇匀，置于暗处30分钟，再用5％氢氧化钠溶液调节至中性，加10ml甲苯振摇2分钟，静置分层，弃去水层，甲苯层通过棉花栓过滤于比色皿中，于420nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线(见图1)。1.2.4.4残留无机硒含量的测定取适量样品，5000rpm高速离心机离心30min，取20ml上清夜，加水至35ml，加入5％EDTA-2Na溶液1ml，以下同标准曲线。根据样品测得的吸光度，从标准曲线中查得相应的硒含量，此为无机硒含量。1.2.4.5有机硒含量的测定有机硒含量=总硒含量一残留无机硒含量2结果与分析2.1正交因素水平确定2.1.1培养时间选择发酵培养时间直接影响酵母生长的几个不同阶段，酵母中的硒含量取决于酵母生长过程中吸收、转化无机硒的量。10试管种子分别接种到含亚硒酸钠9mg/L、12mg/L、15mg/L培养基中，28℃培养，每隔一定时间测定酵母的数量，获得酵母生长曲线（如图2）。从图2可以看出，培养至25~35h时酵母生长达到稳定期，酵母产量基本接近最高值。因此在后面的正交试验中选取了发酵培养时间为25h、30h、35h三个水平。2.1.2硒浓度的选择酵母对于硒的转化，在一定的浓度下可以将无机硒转化为有机硒。在高浓度硒存在的环境下，酵母虽然仍可以生长，但体内硒过量而转化为单质硒沉积在细胞内，使酵母出现微红色，甚至红色。因此由实验得到在硒浓度为20mg/L条件下，酵母呈现出微红色，此值可认为是一个临界点，即菌体内无机硒开始积累的标志，因此在正交试验中选取了发酵培养基中硒浓度12mg/L、16mg/L、20mg/L三个水平。2.1.3接种量和培养基的选取在一般的发酵培养中接种量多为10左右，此处为了研究初始菌量对硒产量的影响，选取了8、10、12三个水平。而对于不同的培养基条件，在实验中发现其酵母生长量基本一致，即在麦芽汁中和YEPD培养基中的酵母生长情况是一致的，二者没有太大的区别。故在后续实验中选取了YEPD培养基作为实验用培养基。2.2富硒工艺优化酵母富硒工艺的优化，是以酵母中的硒含量及有机硒转化率的高低来衡量的，通过以上分析，影响酵母中硒含量及有机硒转化率的主要因素有以下3个，富硒正交试验各因素水平见表1表1富硒正交试验因素水平表因素水平123A（Se含量mg/L）121620B（培养时间/h）253035C（接种量/）81012通过正交试验确定酵母发酵培养的最优工艺条件，以上面所取的三个因素，三个水平进行正交试验。试验结果见表2。表2富硒正交试验结果试验号

试验条件试验结果ABC硒含量（mg/L）转化率（）11116.6266.5421226.0160.3931337.3271.46422112.3982.62523212.0278.45621310.1067.41733113.2464.31831213.2164.02932312.7872.36Ⅰ/36.659.9810.75Ⅱ/311.5010.3910.41Ⅲ/3RcR6.430.880.68A3B3C1Ⅰ/366.1365.9971.16Ⅱ/376.1671.7967.62Ⅲ/3RcR10.035.803.54A2B2C1从表2上比 较可经看出，转化率高的最优化组合是A2B2C1，即加硒量为16mg/L、接种量为8、在28℃培养30h。同时可以从表2看出，三种因素在所选水平范围内，对各项指标的影响是不同的。对硒产量和硒的转化率影响最大的是硒的添加量和培养时间；如果仅从硒产量的角度而言A3B3C1组合产有机硒产量较高，这是因为培养基中的高硒浓度有利于硒的产量提高，但是这样并不经济。通过这种方法虽可以在一定的范围内使有机硒的含量得以提高，但是无机硒的转化率却比较低，致使发酵液中的无机硒残留较高，不利环境保护和资源的有效利用。所以这一组合并不可行。在对培养时间的选取上，当菌量达到一定的浓度后，其有机硒的产量也不会发生太大的变化，所以应该在保证高硒转化率的前提下，尽可能的缩短发酵时间。这是因为当酵母生长平衡期后，要有相当数量的酵母发生自溶，使体内以积累的有机硒释放到培养基质中而造成浪费。从经济合理的角度出发，综合以上几种因素，我们选取了A2B3C1为最优组合。在该条件下，有机硒的产量可达12.39mg/L、无机硒的转化率可达82.62。3结论3.1该酵母菌的最优条件组合是：加硒量16mg/L、接种量8、在28℃下培养30h。在该条件下，生产富硒酵母时，有机硒的含量和硒的转化率分别可达12.39mg/L和82.62；3.2酵母的富硒能力在20mg/L的浓度下，随浓度的升高而提高其转化率，但在该浓度之上时，这种转化能力开始降低；3.3酵母大都具有较强的富硒能力，也可作为富硒酵母生产菌种。参考文献[1]王岁楼.利用活性干酵母发酵生产富硒酵母.郑州轻工业学院学报,20__,16(2):3-6.[2]李肖春.富硒酵母的筛选.天津轻工业学院学报,20__.3:25-28.[3]刘曲滨.富硒酵母中硒含量的测定..广州食品工业科技,20__,16(3):33-35.[4]王少为.人体必需微量元素－硒.广东微量元素科学,1999,6(6):50-51.