一株粘细菌Myxococcus sp. STXZ90的分离鉴定及生物活性分析

DOI：10.7612/j.issn.10002537.2017.02.004

摘要采用灭活大肠杆菌诱导法分离粘细菌，通过形态观察、生理生化实验、16S rRNA基因序列同源性分析，对其进行鉴定并归类.并通过平板对峙法、肿瘤细胞毒性实验等检测粘细菌代谢产物的抑菌和抗肿瘤活性，RPHPLC分离抗肿瘤活性物质.分离得到一株粘细菌，鉴定结果表明该菌株为黄色粘球菌，将其命名为Myxococcus sp. STXZ90（简写为STXZ90）.抑菌试验表明，STXZ90对多种人类病原菌及鱼类致病细菌如产气肠杆菌、嗜水气单胞菌等具有较高的抑制活性；STXZ90发酵上清的甲醇粗提物对多种肿瘤细胞具有广谱高效的抑制肿瘤细胞活性，对Hep3B，Hela和HUVEC等的最低半抑制浓度（IC50）为0.279～1.228 mg/L.对该甲醇粗提物进行RPHPLC分离，得到2个较纯的单峰物质，体外肿瘤细胞实验结果显示该组分有较强的抑制肿瘤细胞活性.

关键词粘细菌；次级代谢产物；高效液相色谱

中图分类号Q939文献标识码A文章编号10002537（2017）02002508

On Isolation， Identification and Bioactivitiy of Myxococcus sp. STXZ90

HUANG Tonglong， LEI Lianghuan， LIAO Jiyan， ZHOU Cai， WU Yujing，

LI Chun， WEI Hui， XIA Liqiu， DING Xuezhi， ZHANG Youming*

（State Key Laboratory Breeding Base of Microbial Molecular Biology， College of Life Science， Hunan Normal University， Changsha 410081， China）

AbstractThe inactivated Escherichia. colidependent fruiting baiting technique was used to isolate myxobacterial strains. Based on the phylogenetical characteristics， physiological and biochemical properties and 16S rRNA gene sequence homology analysis， the isolated strain has been identified and classified. The inhabitation of the strain to different pathogens and tumor cells were detected by the Plate Confrontation Culture Method and tumor cell toxicity experiment. The antitumor substance was further purified by RPHPLC. Our results showed that the strain belonged to myxococcus xanthus and thus it was named as Myxococcus sp. STXZ90（STXZ90）. The antibacterial experiment indicated that STXZ90 had bacteriostatic activity to different human pathogens and fish pathogens， such as Enterobacter aerogenes， and Aeromonas hydrophil. The methanol elution of the fermented supernatant of STXZ90 exhibited a broad spectrum and high effect on various tumor cell lines. The IC50（half maximal inhibitory concentration） to Hep3B，Hela， and HUVEC were between 0.279 to 1.228 mg/L. The methanol elution was further purified by RPHPLC with 2 single peak fragments obtained， which displayed strong inhibitory activities to cancer cells.

Key wordsMyxobacteria； secondary metabolite； HPLC

粘菌（myxobacteria）是土壤中较为常见的一类单细胞革兰氏阴性细菌，营养细胞杆状，具有复杂的多细胞行为，可以滑行运动，能产生结构各异、种类多样、活性高效的次级代谢产物，在农业、医药、生态环境等方面具有重要的研究应用价值[19].

据Dawid报道，在2 000多株溶细菌的粘细菌中，有55%能产生生物活性物质；在700多株溶纤维素的粘细菌中，有95%可产生生物活性物质[10].安布替星（ambruticin）是粘细菌来源的第一个确定化合物结构的生物活性物质，分离自纤维堆囊菌（Sorangium cellulosum）的次级代谢产物，具有抗真菌作用，可用于及其辅助用药[11].抗生素TA是1973由Rosenberg等[12]从粘细菌中分离得到的第一个抗生素，来自橙色粘球菌（Myxococcus fulvus）的次级代谢产物.纤维堆囊菌产生的epothilons是与紫杉醇具有相同作用机制的十六元聚酮大环内酯化合物，是一种很好的抗癌新药，对乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等都有很好的抑制效果，且IC50（最低半抑制浓度）都在纳摩尔水平[13]. 粘细菌的次级代谢产物种类丰富，大部分具有抑菌、抗肿瘤活性，是新型生物活性物质的来源[1415].本研究对分离纯化的粘细菌进行形态观察、菌种鉴定分类归属，丰富了粘细菌菌种资源，同时为今后粘细菌的分离纯化和次级代谢产物中新型活性物质的筛选打下良好基础.

1材料与方法

1.1材料

1.1.1土样通过多点取样法从湖南益阳菜地采集得到.

1.1.2供试菌株人类病原细菌产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、白色念球菌（Monilia albican）及鱼类致病细菌嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）、豚鼠气单胞菌（Aeromonas caviae）、迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda），均由本实验室保藏.

1.1.3供试细胞株小鼠黑色素肿瘤细胞（B16）、人肝癌细胞（SMMC7721）、小鼠乳腺癌细胞（4T1）、人类宫颈癌细胞（HeLa）、人类肝癌细胞（Hep3B）、人结直肠癌细胞（SW480）、人正常细胞脐静脉上皮细胞（HUVEC），均由本实验室保藏.

1.1.4培养基WAX固体培养基（CaCl2・2H2O 1 g， HEPES 0.5 g， Agar 15 g，H2O 1 000 mL，pH 7.2）；MD1液体培养基（Casein Peptone 6 g，Starch 2 g，MgSO4・7H2O 2 g，CaCl2・2H2O 0.4 g，H2O 1 000 mL，pH 72）；LB液体培养基（Tryptone 10 g，Yeast extract 5 g，NaCl 10 g，H2O 1 000 mL）；CTT固w培养基（Casein Peptone 10 g， MgSO4・7H2O 1.97 g， KH2PO4/K2HPO4 Buffer（pH 7.6） 1 mmol/L， Tris・HCl Buffer（pH 7.6） 10 mmol/L， Agar 15 g， H2O 1 000 mL， pH 7.6）.

1.2粘细菌的分离

1.2.1土样的预处理采集土样，风干研磨，过筛，称取土样3 g，加入到2 mL抗生素混合液中（庆大霉素30 g/L，卡那霉素8 g/L，氨苄青霉素30 g/L），再加入15 g/L的放线菌酮1 mL，55℃水浴10 min，放置过夜，在分离前再55 ℃水浴10 min[16].

1.2.2灭活大肠杆菌诱导法离心收集大肠杆菌，高温灭菌，再将大肠杆菌糊用剪尖的蓝色枪头滴加在WAX平板上（WAX平板已加入25 mg/L放线菌酮），将处理后的土样滴加在灭活大肠杆菌旁，30 ℃培养3 d后开始观察子实体形成情况.

1.2.3粘细菌的纯化大肠杆菌有被蚀刻的痕迹、且长出粘细菌子实体时，在体式显微镜下，反复多次将子实体转接到新的WAX平板上，直至LB液体培养基验纯培养时，培养过夜后粘细菌呈块状或薄膜状，而培养液澄清，此时，则认为已获得纯培养，然后将纯化的粘细菌转接到MD1液体培养基中，30 ℃，150 r/min，培养7 d，25%甘油保藏，置于 -80 ℃冷冻保藏.

1.3菌株鉴定

1.3.1形态观察将分离纯化得到的粘细菌接于WAX平板上，30 ℃培养7 d后，体式显微镜下观察菌落及子实体形态.并将该菌接到MD1液体培养基中培养7 d后，取菌体进行革兰氏染色，在普通光学显微镜下观察.并取菌体在扫描电镜下观察其营养细胞形态.

1.3.2生理生化特征观察参照《常见细菌系统鉴定手册》[17]和Lyudmila（2000）[18]等的方法进行.

1.3.316S rRNA基因扩增、测序与构建系统发育树参照文献[16]中的方法进行.

1.4STXZ90菌株生长曲线的测定及其在不同生长时期的抗肿瘤活性

1.4.1STXZ90菌株生长曲线的测定本研究采用称重法测粘细菌的生长量：从平板上将粘细菌转接到MD1液体培养基中，30 ℃摇床，扩大培养4 d，然后将其转接到500 mL装有玻璃珠和MD1液体培养基的摇瓶中，摇床培养3 d后，按5%的接种量将其转接至30个摇瓶中，每隔12 h取一瓶离心收集菌体，去掉表面水分，称取并记录质量.

1.4.2STXZ90菌株不同生长时期的抗肿瘤活性测定取迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期的发酵上清各1 mL，过滤除菌后，取10 μL检测其细胞毒性，同时取MD1液体培养基10 μL作为对照，发酵上清和对照各做3 个平行.培养24 h后，观察细胞形态变化.

1.5STXZ90菌株的抑菌活性

采用平板对峙培养法（Plate Confrontation Culture Method），检测STXZ90对供试人类病原细菌产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、白色念球菌（Monilia albican）及鱼类致病细菌嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）、豚鼠气单胞菌（Aeromonas caviae）、迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）的抑菌效果.粘细菌在MD1液体培养基中培养7 d左右至含有大量成团菌体时，用枪头打散菌体后，取1 mL菌体，均匀涂布于CTT固体平板上，30 ℃恒温倒置培养7 d左右至子实体长出.取各受试菌的菌保液在LB固体培养基平板上稀释划线，30 ℃恒温培养12～24 h，分别转接到装有1.4 mL LB液体培养基的1.5 mL EP管中，在管盖上用注射器针头扎小孔，37 ℃，1 000 r/min，振荡培养12 h，各取100 μL，用涂布器均匀涂抹于CTT固体培养基平板上，待平板吹干后，用蓝色枪头扎取培养平板上的STXZ90菌株，将其倒扣在涂布好的指示菌平板上，用同样的方法扎取CTT固体培养基做对照，每组3个平行，30 ℃恒温倒置培养6 d[19].

1.6STXZ90菌株抗肿瘤活性物质的分离纯化

1.6.1XAD16树脂吸附STXZ90菌株于MD1液体培养基中发酵7 d后，取发酵上清液300 mL，12 000 r/min离心去菌体，取6 mL XAD16树脂湿热灭菌后，加入粘细菌发酵上清液中，转入500 mL大摇瓶，在30 ℃摇床内，转速100 r/min，使活性物质被充分吸附，放置2～3 d.

1.6.2XAD16树脂洗脱用滤纸过滤得树脂，加入10倍原始上清液的无菌水洗涤树脂后，用10倍树脂体积的甲醇对树脂进行洗脱，除菌后进行多种细胞的毒性实验，检测其活性，并用MTT法检测其对多种细胞的抑制率并计算IC50.

1.6.3甲醇粗提物的RPHPLC分析抽滤色谱纯乙腈和水作流动相溶液，在安捷伦1290上进行C18柱反相高效液相色谱，检测甲醇粗提物，根据色谱分离峰图谱来判断粗提物的物质复杂程度.对分离较好的峰进行反复收集，再进行肿瘤细胞毒性试验，检测其抗肿瘤活性.

2结果

2.1菌株鉴定

2.1.1形态特征从图1可以看出，STXZ90培养液呈黄色，在WAX平板上表现出运动性，能蚀刻大肠杆菌，子实体由中心向四周辐射状展开，子实体周围有透明的液体，菌落粘稠难挑取，革兰氏染色呈阴性，扫描电镜显示细胞呈细长杆状，细胞末端呈略尖的锥形，细胞大小约为4.0 μm×0.7 μm，无鞭毛.

2.1.2生理生化特征STXZ90生理生化实验结果见表1，与伯杰细菌鉴定手册中粘细菌特性相符合.

2.1.3系统发育树的构建STXZ90的16S rRNA 基因序列长度为1 602 bp，在NCBI上经过BLAST分析，结果表明该菌株属于粘球菌属，与Myxococcus sp. XAC 03有最高相似性，同源性为99%，但STXZ90在系统进化树上与各亚种分开形成新的分支，不与Myxococcus sp. XAC 03属于同一亚种，结合16S rRNA序列分析和菌株的形态及生理生化结果，将STXZ90命名为Myxococcus sp. STXZ90.利用MEGA 6的Kimura2Parameter模型，运用邻接法（NJ）构建的系统发育树如图2所示.

2.2STXZ90菌株在不同生长时期代谢产物的抗肿瘤活性利用称重法测定STXZ90的生长曲线，并取其4个生长时期，即迟缓期（12 h）、对数期（36 h）、稳定期（96 h）和衰亡期（240 h）的发酵上清，检测其细胞毒性.该菌在接种后便迅速调整进入对数生长期，在72 h菌体质量达到最大，进入稳定期，但其稳定期在整个细胞周期中占比少，时间只有对数期的一半，在108 h即进入衰亡期，菌体数量开始减少，如图3所示.细胞进入衰亡期后生物量减少，说明衰亡期细胞可能发生裂解或营养细胞形成抵御不良环境的粘孢子.

图4显示了不同生长时期的STXZ90发酵上清对小鼠黑色素瘤细胞B16的增殖抑制效应，从图中可知，在STXZ90对数期，即12 h时，其发酵上清就显示了一定程度的抑制效应，随着时间增长，36 h和96 h时抑制效应也相应增强，这说明在对数期STXZ90产生的抗肿瘤细胞活性物质逐渐积累，从对数期持续到稳定期.进入稳定期（96 h）后，抗肿瘤活性物质可能并未继续积累，图4显示240 h抗肿瘤活性并未明显高于96 h，说明活性物质的积累主要在对数期或稳定期，可能是活性物质合成的代谢途径受到反馈抑制.后期拟通过改变培养条件或采用分子克隆手段突变代谢途径中的某些碱基来增加活性物质的产量.

2.3STXZ90菌株的抑菌活性

如图5～6所示，以平板上接种的STXZ90为中心出现的透明圈显示了STXZ90对5种受试人类致病细菌和4种鱼类致病细菌的抑菌活性，透明圈的大小显示出STXZ90对不同致病细菌的抑制效果有明显的差异性，其对产气肠杆菌Enterobacter aerogenes、鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium、普通变形杆菌Proteus vulgaris、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、白色念球菌Monilia albican、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila、维氏气单胞菌Aeromonas veronii、豚鼠气单胞菌Aeromonas caviae、迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda具有高效的抑制活性.STXZ90对多种人类致病菌和鱼类致病菌具有抑制作用，说明STXZ90具有开发抗菌药物的价值，同时对于鱼类疾病的防治也具有重要意义.

2.4STXZ90菌株抗肿瘤活性物质的分离纯化

将甲醇洗脱物配置成不同浓度梯度，分析其对不同肿瘤细胞毒力大小，以测其对多种细胞的半致死浓度.浓度为1.33 mg/L的甲醇洗脱物能很好地抑制多种肿瘤细胞，且对正常细胞HUVEC作用效果比较弱（见图7）.在此浓度下，该粗提物对Hep3B，Hela，SMMC7721，B16，4T1，SW480和HUVEC的抑制率分别为：90.06%，85.42%，88.10%，89.88%，86.34%，65.34%和34.94%（如图8）.利用SPSS 13.0软件统计分析该粗提物对各肿瘤细胞最低半抑制浓度（IC50），其对Hep3B，Hela，SMMC7721，B16，4T1，SW480和HUVEC的最低半抑制浓度分别为：0.328，0.454，0.279，0.453，0.633，0.926和1.228 mg/L（表2）.本文结果显示STXZ90的发酵粗提物表现出广谱高效的抗肿瘤活性，对发酵粗提物中活性物|进行分离纯化并找到活性最高组分具有重要意义.

对甲醇洗脱物进行C18柱反相高效液相色谱分析，见图9.收集分离的各个单峰，冷冻干燥去除色谱流动相后，进行肿瘤细胞毒性实验.如图10所示，保留时间分别为12.920和13.804 min的单峰物质对B16细胞有细胞毒性，其中保留时间为13.804 min的峰物质活性最高且峰型对称（图10c），说明此物质较纯.与加甲醇对照组相比，活性组分作用后肿瘤细胞数量明显减少，且倒置显微镜观察发现其不能保持贴壁形态，细胞形态不饱满，两端出现抽丝且变圆.

3论

粘细菌在土壤中比较常见，但由于粘细菌很难由单个的细胞形成单克隆，且代时较长，易于夹杂其他细菌、真菌、阿米巴和线虫等特点，给粘细菌的分离和纯化带来极大困难.因此，粘细菌和一般细菌的分离纯化不同.一般情况下，得到一株纯的溶菌群类的粘细菌菌株需要几个月的时间，而某些纤维素类的粘细菌耗时更长，常需 1～2 年的时间[20].为提高粘细菌筛选效率，利用现代分子技术建立新筛选模型成为粘细菌分离纯化的研究热点.如蒋德明等[21]利用分子生物学技术来分析海底粘细菌的多样性，建立基因库；高秀珍[22]利用微包埋技术，获得粘细菌的单克隆，提高了纯化的效率.但由于各种条件的限制，这些分离纯化方法的适用范围并不广.本实验采用大肠杆菌诱导子实体法，从土壤中分离得到粘细菌STXZ90，属于粘球菌属[23].本文的抑菌实验表明，STXZ90对多种人类病原菌及鱼类病原菌如产气肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌等都有较高的抑制活性.作者推测STXZ90的抑菌功能与其产生水解酶的功能有关.已有研究发现，粘细菌在营养条件缺乏时能通过产生水解酶降解多种细菌提供营养供自身生长所需，如Hillesland等[24]发现粘球菌能在共培养时降解Escherichia coli， Corynebacterium glutamicum， Micrococcusluteus，Saccharomyces cerevisiae等多种细菌.近年来从粘球菌中分离得到多种抗肿瘤活性物质，如3Omethylmyxochelin A[15]及Myxothiazol[25]等.本研究中细胞毒性实验表明，STXZ90的甲醇粗提物对Hep3B，Hela，SMMC7721，B16，4T1，SW480和HUVEC的最低半抑制浓度分别为：0.328，0.454，0.279，0.453，0.633，0.926和1.228 mg/L.将STXZ90的甲醇粗提物进行RPHPLC分析，得到2个单峰物质，均显示了不同程度的B16肿瘤细胞毒性，其保留时间分别为12.920和13.804 min，其中保留时间为13804 min的峰物质活力最高且最纯净.具有抗菌和抗肿瘤活性的粘细菌新菌株STXZ90的发现，丰富了微生物药用菌种资源库，也为药物先导分子的研发进行了初步探索.

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